寫在前面

• 在讀這篇文獻(xiàn)之前：

  期初看到這篇文獻(xiàn)的時(shí)候，感覺這不是把我想做的做了嘛，開個(gè)玩笑，只是這個(gè)問題在做植物根系分泌物中是很重要的。

  算是一個(gè)小領(lǐng)域的基礎(chǔ)問題。

  所以我十分迫切的想看看作者究竟做了寫什么，能回答什么樣的問題。

• 在讀完這篇文獻(xiàn)之后：

  作者測(cè)定了接近200個(gè)代謝組，按照國(guó)內(nèi)價(jià)格的話，差不多是10萬塊。

  但這可能是他們自己測(cè)得，其次注釋數(shù)據(jù)庫比較小，我個(gè)人覺得可以用好幾個(gè)庫再次進(jìn)行注釋一遍。

  現(xiàn)在這個(gè)時(shí)代，一百多個(gè)代謝物看樣子是比較少了。

  不過可能也是作者注釋的比較精準(zhǔn)，反觀現(xiàn)在有些國(guó)內(nèi)公司，為了讓注釋的代謝物過多，把一些可有可無的也加上了，或者不準(zhǔn)確的也加上了。

• 這篇文章關(guān)注根系分泌物研究的一些基礎(chǔ)問題，這其實(shí)可以標(biāo)志著根系分泌物元年來到了（終于有人關(guān)注這些基礎(chǔ)問題了）。

文獻(xiàn)題目：三種系統(tǒng)發(fā)育不同植物的核心代謝組和根系分泌物動(dòng)態(tài)

• DOI：

  10.1038/s41467-023-37164-x

• 第一作者：

  Sarah McLaughlin

• 通訊作者：

  Trent R. Northen & Joelle Sasse

摘要：

根系分泌物是植物來源的輸出代謝物，可能通過充當(dāng)營(yíng)養(yǎng)和信號(hào)來塑造根相關(guān)的微生物組。然而，根系分泌動(dòng)態(tài)尚不清楚，因此也不清楚分泌的變化是否反映在微生物組結(jié)構(gòu)的變化中。本研究評(píng)估了不同植物物種的分泌物、晝夜分泌動(dòng)態(tài)以及分泌物采樣的伴隨方法方面的共性和差異。由于許多代謝物的豐度會(huì)隨著時(shí)間的推移而飽和，所以應(yīng)該收集幾個(gè)小時(shí)而不是幾天的分泌物。植物在無菌、非無菌或補(bǔ)充糖的環(huán)境中生長(zhǎng)會(huì)顯著改變分泌物特征。擬南芥、二穗短柄草和蒺藜苜蓿的莖、根和根分泌代謝物譜的比較揭示了這些物種之間的明顯差異，但也存在組織和分泌物的核心代謝組。分泌物剖面還表現(xiàn)出晝夜特征。這些發(fā)現(xiàn)增加了未來分泌物研究的方法學(xué)和概念基礎(chǔ)，以提高對(duì)植物-微生物相互作用的理解。

研究背景：

植物根部向根際分泌大量化合物。分泌物影響碳和養(yǎng)分循環(huán)，塑造土壤的理化特性，并作為根系相關(guān)微生物群落的養(yǎng)分和信號(hào)。根系分泌物被認(rèn)為是植物生態(tài)學(xué)和研究的一個(gè)重要功能性狀，因?yàn)樗鼈兣c植物養(yǎng)分利用策略相關(guān)。

根系分泌物被認(rèn)為是影響植物微生物組相互作用形成的一個(gè)因素。這方面的證據(jù)來自微生物組和分泌物研究中的許多觀察結(jié)果：微生物組和分泌物概況在植物物種、栽培品種、野生和現(xiàn)代品種之間是不同的。微生物組組成和分泌物隨植物發(fā)育階段、晝夜時(shí)間點(diǎn)以及非生物和生物脅迫而變化。例如，在幾種單子葉植物和雙子葉植物物種中，糖分泌減少而有機(jī)酸分泌沿著發(fā)育梯度增加。此外，還觀察到一些分泌物的晝夜波動(dòng)，例如某些脂質(zhì)、單一有機(jī)酸（例如檸檬酸和麥根酸）以及類黃酮和芥子油苷。單一研究將微生物組的變化與分泌的改變聯(lián)系起來：在擬南芥中，三萜分泌的變化改變了微生物組組成，葉病原體感染改變了蘋果酸分泌，吸引了地下生物控制微生物，分泌的酚酸被植物相關(guān)微生物選擇性代謝。

隨著植物生長(zhǎng)，糖類的分泌逐漸減少，有機(jī)酸的分泌逐漸增多。

一系列的方法被開發(fā)出來用于分泌物分析。植物可以在無菌或非無菌環(huán)境、土壤或水培中生長(zhǎng)，分泌物可以收集在各種溶液中，例如去離子水、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或土壤清洗液。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)因素會(huì)改變植物環(huán)境，因此有可能改變植物的新陳代謝，并隨之改變分泌。例如，與生長(zhǎng)培養(yǎng)基相比，在去離子水中收集的分泌物通常含有更高水平的碳和氨基酸，這可能是由于根和溶劑之間強(qiáng)烈的滲透不平衡。

滲透不平衡導(dǎo)致分泌物會(huì)產(chǎn)生什么變化呢？

分泌物收集持續(xù)時(shí)間也會(huì)影響代謝曲線。收集水稻分泌物2小時(shí)，總有機(jī)碳分泌率（碳水化合物和有機(jī)酸）估計(jì)高于4小時(shí)或6小時(shí)，與植物發(fā)育階段無關(guān)。各種植物物種的外部氨基酸濃度在分泌的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)增加，直到24小時(shí)，然后保持穩(wěn)定。檢測(cè)分泌物的另一個(gè)主要決定因素是無菌或非無菌生長(zhǎng)環(huán)境。對(duì)于在非無菌條件下生長(zhǎng)的番茄，在分泌物中無法測(cè)量到糖或有機(jī)酸，這可能是由于微生物活動(dòng)，而無菌番茄在數(shù)小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出μM級(jí)別的有機(jī)酸分泌。在非無菌設(shè)置中，可以添加滅菌劑來阻止微生物代謝，但它們也可能會(huì)改變植物的分泌曲線。然而，大多數(shù)化學(xué)類別的分泌動(dòng)態(tài)仍未得到探索。

這里注意分泌的濃度問題？微摩爾是一個(gè)常見的濃度。

很少有研究分析土壤種植植物的分泌物，這通常是通過使用膜或滲濾液收集，或通過用水或有機(jī)溶劑清洗花盆來實(shí)現(xiàn)空間分辨率。在非無菌環(huán)境或土壤基質(zhì)中存在的微生物會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)出復(fù)雜的代謝物概況。在此類實(shí)驗(yàn)裝置中鑒定分泌物代謝物并非易事?？偠灾囗?xiàng)研究表明，分泌是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，取決于許多環(huán)境和實(shí)驗(yàn)因素。

土壤中，也就是原位，檢測(cè)根系分泌物研究我們一直在做，但是由于復(fù)雜程度，所以都稱之為根際代謝物。

雖然很明顯分泌是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，但大多數(shù)影響分泌的參數(shù)尚未被系統(tǒng)地探索。大多數(shù)研究關(guān)注少量實(shí)驗(yàn)或生物學(xué)參數(shù)如何改變一種或幾種化學(xué)類別的分泌。缺乏系統(tǒng)分析大量分泌代謝物動(dòng)態(tài)的綜合研究，如分泌物收集持續(xù)時(shí)間或生長(zhǎng)培養(yǎng)基對(duì)分泌的影響等實(shí)驗(yàn)因素的影響，以及對(duì)不同植物物種分泌物異同的綜合分析。本研究表明實(shí)驗(yàn)因素和生物學(xué)因素都會(huì)影響根系分泌物。我們系統(tǒng)地評(píng)估了兩個(gè)技術(shù)和兩個(gè)生物學(xué)方面：（i）收集持續(xù)時(shí)間對(duì)分泌物的影響，（ii）生長(zhǎng)環(huán)境（無菌，非無菌，加糖）對(duì)分泌曲線的影響，（iii）多個(gè)系統(tǒng)發(fā)育較遠(yuǎn)的植物物種的分泌物和組織代謝特征的異同，以及 (iv)與植物組織和分泌物的代謝特征相關(guān)的晝夜特征。

我們發(fā)現(xiàn)幾個(gè)小時(shí)的收集時(shí)間最適合捕捉許多分泌物的動(dòng)態(tài)化合物，但低豐度化合物可能需要幾天的時(shí)間。此外，與對(duì)照條件相比，在補(bǔ)充蔗糖的條件下的分泌物中檢測(cè)到更高水平的碳水化合物。分泌曲線和根形態(tài)在無菌和非無菌條件下顯著變化。雙子葉植物擬南芥、單子葉植物二穗短柄草和豆科植物苜蓿的根和分泌物的大約三分之二的化合物在所有三個(gè)物種中都被檢測(cè)到。其余三分之一的化合物對(duì)一個(gè)或兩個(gè)物種具有特異性。此外，我們發(fā)現(xiàn)7-32%的分泌代謝物具有晝夜特征（取決于物種）。本研究介紹了核心代謝組的概念：核心代謝組包含存在于大多數(shù)植物物種中的代謝物，類似于與植物組織相關(guān)的核心微生物組。我們假設(shè)核心分泌物負(fù)責(zé)將核心微生物組募集到根部。相比之下，特定于物種或植物家族的分泌物會(huì)導(dǎo)致更特定的植物微生物關(guān)聯(lián)。

我們?cè)?022年的Microbiome中提到了核心代謝物，認(rèn)為這與植物狀態(tài)有關(guān)聯(lián)，這里的作者也有相同的思考，這表明了一種系統(tǒng)性的適應(yīng)性。

研究結(jié)果：

結(jié)果一：大多數(shù)代謝物可通過較短的分泌物收集時(shí)間檢測(cè)到，但較長(zhǎng)的收集時(shí)間會(huì)增加信號(hào)

圖1 三個(gè)物種的根系分泌動(dòng)態(tài)

我們首先評(píng)估了技術(shù)問題，以確定此處介紹的其余實(shí)驗(yàn)的分泌物收集參數(shù)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們旨在確定分泌代謝物的時(shí)間動(dòng)態(tài)，以確定最佳分泌物收集持續(xù)時(shí)間，即分泌物收集的最短的時(shí)間點(diǎn)，仍然能確保一個(gè)良好的信號(hào)，以及分泌物信號(hào)在以后的時(shí)間點(diǎn)可能的飽和度。為此，模式單子葉植物(二穗短柄草)、模型雙子葉植物(擬南芥)和模型豆類植物(蒺藜苜蓿)在無菌水培裝置中生長(zhǎng)三周。在收集期開始時(shí)更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中收集分泌物五種不同的持續(xù)時(shí)間，從0.5小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、1天到4天。對(duì)于這三種植物，總共檢測(cè)到63種分泌代謝物。在已鑒定的化合物中，有氨基酸和其他有機(jī)酸、碳水化合物、核苷、核苷酸和衍生物，以及苯類化合物。在任何配對(duì)比較中，發(fā)現(xiàn)16%（蒺藜苜蓿）、37%（二穗短柄草）和52%（擬南芥）化合物有時(shí)間上的動(dòng)態(tài)變化，其他代謝物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持相似水平。

主成分分析(PCA)顯示三個(gè)物種中的兩個(gè)隨著時(shí)間的推移收集的分泌物剖面有連續(xù)變化。蒺藜苜?？傮w上顯示出更多的差異，并且時(shí)間點(diǎn)的分離不太清楚，可能是因?yàn)橛糜谠撐锓N的種子的遺傳多樣性更高（圖1）。在最早和最晚時(shí)間點(diǎn)（0.5小時(shí)和4天）之間發(fā)現(xiàn)了較大差異。對(duì)這些時(shí)間點(diǎn)之間不同的二穗短柄草代謝物的時(shí)間模式的深入分析揭示了各種時(shí)間行為，從線性、指數(shù)或?qū)?shù)增加到鐘形動(dòng)態(tài)。大多數(shù)代謝物強(qiáng)度隨時(shí)間增加。僅在1天和4天之間的少數(shù)情況下觀察到減少。此外，所有研究的代謝物類別都顯示出相似的時(shí)間動(dòng)態(tài)。因此，收集時(shí)間的選擇不會(huì)使檢測(cè)偏向特定的化學(xué)類別。

為了選擇最佳分泌物收集持續(xù)時(shí)間，將代謝 物豐度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為存在-不存在（在50%以上的樣本中高于背景），從而可以比較特定時(shí)間點(diǎn)存在的代謝物數(shù)量。將最新時(shí)間點(diǎn)（4天）設(shè)置為100%，我們?cè)?.5小時(shí)檢測(cè)到16%的化合物，在2小時(shí)檢測(cè)到32%，在4小時(shí)檢測(cè)到61%，在1天檢測(cè)到84%。我們得出結(jié)論，對(duì)于時(shí)間不敏感的實(shí)驗(yàn)，例如生態(tài)型或突變體的比較，較長(zhǎng)的收集時(shí)間可使化合物數(shù)量和強(qiáng)度最大化。然而，較長(zhǎng)的收集時(shí)間可能會(huì)掩蓋較早時(shí)間點(diǎn)存在的差異，并且代謝物再攝取等因素在較高的代謝物濃度下可能更相關(guān)，從而使情況復(fù)雜化。對(duì)于高溫解決方案的實(shí)驗(yàn)，我們建議收集窗口為幾個(gè)小時(shí)。對(duì)于此處介紹的所有進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，選擇了2小時(shí)的分泌物收集窗口。

短時(shí)間收集的代謝物會(huì)有較大差異，持續(xù)一段時(shí)間后收集的可能會(huì)讓低豐度的代謝物出現(xiàn)積累性質(zhì)的差異。在之前我們發(fā)現(xiàn)高豐度和低豐度的代謝物可能是決定微生物的重要因素。結(jié)合這里的觀點(diǎn)可能低豐度代謝物就是信號(hào)物質(zhì)，通過信號(hào)影響微生物，高豐度的通過養(yǎng)分影響微生物。其次中間的這些代謝物，也就是說豐度不高不低的，做什么用呢，這里推測(cè)一下可能是起著滲透壓調(diào)橫作用。并且是輔助作用？

結(jié)果二：植物生長(zhǎng)條件影響分泌物分布

圖3 不同生長(zhǎng)條件下的二穗短柄草分泌物中差異顯著的代謝物

補(bǔ)充蔗糖的植物比無菌生長(zhǎng)的植物分泌更多的碳水化合物（并表現(xiàn)出氨基酸分泌增加的趨勢(shì)），并且它們分泌的有機(jī)雜環(huán)化合物和有機(jī)酸較少（圖2d）。與無菌條件相比，添加蔗糖的植物只分泌C6糖醇、二己糖、谷氨酸及其甲基化形式和甲基戊二酸（圖3a中的前五種化合物）等。谷氨酸是氨基酸代謝的中樞，因?yàn)樗梢赞D(zhuǎn)化為谷氨酰胺和鳥氨酸，并且谷氨酸轉(zhuǎn)化為2-酮戊二酸是其他氨基酸（例如天冬氨酸）的許多酶促轉(zhuǎn)化所必需的。許多連接的氨基酸通過代謝途徑轉(zhuǎn)化為谷氨酸的蛋白質(zhì)在補(bǔ)充蔗糖的植物中也被上調(diào)。谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸代謝也影響核苷和核苷酸代謝，一些核苷在補(bǔ)充蔗糖的條件下也會(huì)以較高水平分泌（圖3a）。雖然植物是自養(yǎng)生物，但它們?cè)谶@里似乎是混合營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的，需要補(bǔ)充糖，通過碳水化合物代謝轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響氨基酸和核苷的代謝和分泌。

蔗糖是一種常見碳源，增加碳源會(huì)增加分泌氨基酸。尤其是谷氨酸，作為氨基酸代謝中樞可能調(diào)控各種功能。

非無菌生長(zhǎng)的植物顯示出更高水平的苯并和更低的碳水化合物以及核苷和衍生物分泌的趨勢(shì)（圖2d）。通常，受影響的單一化合物與在補(bǔ)充蔗糖的條件下發(fā)生變化的化合物不同。與無菌條件相比，幾種氨基酸的含量更高。此外，許多有機(jī)酸（例如富馬酸）、苯環(huán)化合物（例如苯甲酸及其衍生物）和有機(jī)雜環(huán)化合物（例如喹啉羧酸及其衍生物）在非無菌條件下的含量高于無菌條件（圖3b）。有趣的是，與土壤相關(guān)細(xì)菌相比，芳香族有機(jī)酸由植物相關(guān)細(xì)菌代謝。因此，許多這些化合物可能在植物微生物相互作用中發(fā)揮作用。

這一點(diǎn)和我們我發(fā)現(xiàn)相同，帶有苯環(huán)的有機(jī)酸或者其他有機(jī)物可能調(diào)控植物微生物互作，并產(chǎn)生宏觀功能特征。

在無菌條件下收集的分泌物中也檢測(cè)到所有在非無菌條件下存在量增加的化合物，盡管有時(shí)含量要少得多。因此，非無菌條件下代謝物水平的增加可能是由于植物代謝的改變，可能是對(duì)微生物存在的反應(yīng)，或者是由于微生物代謝的額外存在。在此數(shù)據(jù)集中未檢測(cè)到報(bào)告為微生物特異性的化合物。有趣的是，與無菌環(huán)境相比，非無菌條件下很少有化合物的豐度降低。由于微生物是異養(yǎng)生物，并且它們必須利用植物來源的化合物進(jìn)行生長(zhǎng)，因此有兩種可能的解釋：要么被微生物耗盡的化合物不屬于該數(shù)據(jù)集，要么感興趣的化合物的分泌率隨著消耗的同時(shí)增加微生物，使得耗盡。我們得出結(jié)論，不同的生長(zhǎng)條件確實(shí)會(huì)導(dǎo)致明顯不同的分泌曲線。因此，在不同生長(zhǎng)條件下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)比較并非微不足道，應(yīng)該避免。此處提供的所有進(jìn)一步數(shù)據(jù)均來自在無菌、無蔗糖補(bǔ)充條件下生長(zhǎng)的植物。

結(jié)果三：三種植物的不同根莖代謝特征

圖4 根系代謝物的物種特異性模式

不同的植物物種具有不同的代謝能力并組裝不同的微生物組。我們想知道它們的分泌物特征有多大不同，以及是否在分泌物中可檢測(cè)到晝夜特征。、二穗短柄草、擬南芥和蒺藜苜蓿被選為單子葉植物、雙子葉植物和雙子葉豆科植物的代表，用于收集晝夜分泌物。根和莖的組織也在白天和夜晚結(jié)束時(shí)被收集。

總體而言，在這三種植物的根和莖中鑒定出143種代謝物。在莖組織中，85%的檢測(cè)化合物在至少一對(duì)配對(duì)比較中存在顯著差異，而在根組織中，只有38%的化合物是不同的。然而，兩種組織類型根據(jù)PCA圖上的植物種類清楚地分開。在單子葉植物二穗短柄草莖與雙子葉植物莖(67%)之間檢測(cè)到最大差異，而雙子葉植物莖之間的差異約為一半。通常，根之間的差異小于莖之間的差異，其中二穗短柄草與蒺藜苜蓿最大，為27%，而其他兩個(gè)比較較小，為20%。顯著不同的根代謝物的熱圖顯示存在六個(gè)簇（圖 4）。第2和第4簇由單一物種二穗短柄草中豐度最高的代謝物組成，而其他簇由兩個(gè)物種中高豐度的代謝物組成，而另一個(gè)物種的代謝物豐度較低：第1、6簇：擬南芥 (A)，二穗短柄草(B)>蒺藜苜蓿(M)，第3簇：M、B>A，第5簇：A、M>B。在莖中，與其他相比，二穗短柄草中的許多代謝物豐度較高物種，其次是蒺藜苜蓿和擬南芥。在比較單個(gè)物種的根與莖時(shí)，還發(fā)現(xiàn)了明顯不同的代謝特征。蒺藜苜蓿的差異最大，為76%，其次是擬南芥，為33%，二穗短柄草為19%。當(dāng)按組織或物種繪制時(shí)，在組織數(shù)據(jù)中無法檢測(cè)到晝夜特征。

結(jié)果四：具有晝夜特征的三種植物的不同分泌物概況

圖5 分泌物剖面的晝夜變化

根系分泌物的代謝特征在三種不同物種之間也明顯不同（圖 5a-c）。盡管在組織中未檢測(cè)到晝夜差異，但分泌物顯示出晝夜特征（培養(yǎng)基分別在白天和夜晚開始時(shí)發(fā)生變化，收集分泌物2小時(shí)，圖5a）。本實(shí)驗(yàn)共評(píng)估了74種代謝物。擬南芥在一天結(jié)束時(shí)收集的分泌物樣本與在夜間收集的分泌物樣本之間表現(xiàn)出最大的差異，而蒺藜苜蓿的差異最小（圖 5d）。總體而言，在一天結(jié)束時(shí)兩個(gè)物種之間77%的分泌代謝物存在差異，而在任何夜間比較中只有28%。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)在擬南芥和二穗短柄草之間表現(xiàn)出最大差異，其次是擬南芥和蒺藜苜蓿（圖5b、c）。在一個(gè)物種中，48%的代謝物在白天結(jié)束時(shí)和夜晚結(jié)束時(shí)有所不同。總之，種間差異在莖中最大，其次是日間分泌物、根和夜間分泌物（圖5b、c）。與一天結(jié)束相比，兩個(gè)晝夜時(shí)間點(diǎn)之間超過90%的不同化合物在晚上結(jié)束時(shí)較低，只有肉桂酸、天冬酰胺和胍丁胺硫酸增加（圖 5e)。晝夜不同的代謝物屬于不同的化學(xué)類別。Fishers精確檢驗(yàn)顯示有機(jī)酸、脂質(zhì)的偶然變化比預(yù)期的多，而核苷的變化比預(yù)期的少。不同物種間分泌物晝夜模式的顯著變化很少一致（圖5）。總的來說，我們得出結(jié)論，分泌物顯示出晝夜不同的代謝特征，大多數(shù)化合物在夜間結(jié)束時(shí)的豐度低于白天結(jié)束時(shí)的豐度，這與夜間較低的分泌率一致。

結(jié)果五：根和分泌物的核心代謝組

圖6 根和分泌物中的核心代謝組

我們還對(duì)所有三種植物的根和分泌物中存在哪些化合物感興趣，因?yàn)樗鼈兛梢源怼昂诵拇x組”。這些化合物可能存在于許多植物物種的根部和分泌物中，因此對(duì)于與植物根部相關(guān)的核心微生物組的相互作用可能很重要。

為了研究這個(gè)問題，代謝物的相對(duì)豐度數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換為存在/不存在數(shù)據(jù)（如果在50%以上的樣品中高于背景，則存在），因?yàn)榉置谖锖徒M織的代謝物提取程序不允許進(jìn)行定量比較?？傮w而言，在根和分泌物中檢測(cè)到150種代謝物。檢查顯示，一半的代謝物(43%)存在于所有物種的根中，包括根核心代謝組（圖6）。在所有物種的分泌物中檢測(cè)到五分之一的代謝物(21%)，包括核心分泌物代謝組（圖6）。還在所有物種的根中檢測(cè)到分泌物核心代謝物，因此是核心根代謝組的一個(gè)子集（總根核心代謝組：43%+21%=所有代謝物的64%）。在根和分泌物核心代謝組中檢測(cè)到的化學(xué)類別相似，包括氨基酸和其他有機(jī)酸、核苷和衍生物、碳水化合物和結(jié)合物，在根中則包括脂質(zhì)（圖6）。根核心代謝物沒有表現(xiàn)出晝夜特征，而53%的分泌物核心代謝物在分泌物日間和夜間時(shí)間點(diǎn)之間表現(xiàn)出差異豐度（圖6）。

圖7 根和分泌物中的特定代謝物

在這三種植物物種實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的代謝物中有三分之一未在所有植物物種中檢測(cè)到，因此不是核心代謝組的一部分。當(dāng)進(jìn)一步研究這些代謝物時(shí)，一半或更多的化合物僅在根中檢測(cè)到，而不是在分泌物中，這與核心代謝組數(shù)據(jù)相當(dāng)（圖7）。此外，25-40% 的化合物在根和分泌物中檢測(cè)到，并且僅在分泌物中檢測(cè)到幾個(gè)百分點(diǎn)。一 些代謝物特定于一種植物物種。通常，這些“特殊”代謝物的出現(xiàn)很復(fù)雜?；衔锟梢栽诓煌奈恢茫ǜ?、分泌物或兩者）以及一種或幾種植物物種中找到（圖7）。

總結(jié)：在所有植物物種的根和分泌物中檢測(cè)到三分之二的化合物，包括根和分泌物核心代謝組。我們推測(cè)后者對(duì)于與所有植物物種的根相關(guān)核心微生物組的相互作用很重要。此外，僅在某些物種和地點(diǎn)檢測(cè)到三分之一的化合物。如果未來的實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些化合物的獨(dú)特存在，它們可能負(fù)責(zé)更專門的植物-微生物相互作用。

討論：

在文獻(xiàn)中，分泌物的收集時(shí)間跨度大不相同，從幾小時(shí)到幾天甚至幾周不等。通過我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，幾個(gè)小時(shí)的收集窗口可以檢測(cè)到大多數(shù)化合物。如果需要更長(zhǎng)的收集時(shí)間來增加信號(hào)強(qiáng)度和/或特定代謝物的檢測(cè)，則應(yīng)牢記某些代謝物水平可能已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定水平。此外，必須考慮到必須謹(jǐn)慎解釋此處介紹的時(shí)程研究，因?yàn)榛衔锏姆逯祻?qiáng)度受其他離子存在的強(qiáng)烈影響，使得早期和晚期收集的代謝物分布圖之間的比較具有挑戰(zhàn)性。

二穗短柄草的生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)一步顯著影響檢測(cè)到的分泌物，即使分泌物本身收集在同一介質(zhì)中也是如此。添加糖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基導(dǎo)致二穗短柄草的混合營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、碳水化合物分泌增加以及氨基酸分泌增加的趨勢(shì)。這種分泌物特征的轉(zhuǎn)變對(duì)于研究擬南芥的研究人員尤為重要，因?yàn)樗鼈兺窃谘a(bǔ)充蔗糖的條件下培養(yǎng)的。分泌在無菌和非無菌條件下也不同，具有更高氨基酸分泌的趨勢(shì)，這是之前的觀察結(jié)果。除了氨基酸水平的變化外，大約一半的化合物在無菌和非無菌條件下的豐度存在差異。非無菌條件下的差異分泌可能是微生物代謝或根分泌改變的結(jié)果，例如由微生物信號(hào)或觀察到的根形態(tài)改變引起的。在文獻(xiàn)中，針對(duì)在相同環(huán)境中生長(zhǎng)的植物使用的不同分泌物收集介質(zhì)，報(bào)告了不同的分泌圖譜。與此處使用的等摩爾溶液相比，去離子水中收集的分泌物與等摩爾溶液之間通常會(huì)出現(xiàn)最顯著的差異。通常，與緩沖溶液相比，去離子水中收集的分泌物顯示出更高的代謝物水平。一方面，這可以用代謝組學(xué)分析中的基質(zhì)效應(yīng)來解釋，另一方面可以用擴(kuò)散梯度增加、滲透壓休克或植物細(xì)胞在水中裂解等生物學(xué)因素來解釋。在處理土壤種植的植物時(shí)，測(cè)試了水：溶劑混合物的原位分泌物收集情況。在分泌物中檢測(cè)到的化合物通常是在根部合成的。通常，分泌物代謝特征被發(fā)現(xiàn)不同于根代謝特征。就水稻而言，在分泌物中發(fā)現(xiàn)了63-85%的根代謝物，而在這里，約三分之一的根代謝物也在分泌物中檢測(cè)到。

組織和分泌物剖面在物種之間明顯不同，這是之前對(duì)不同物種、栽培品種和生態(tài)型以及不同光合類型進(jìn)行的觀察。有趣的是，三分之二的化合物存在于擬南芥、二穗短柄草和蒺藜苜蓿的根和分泌物中，分別構(gòu)成了根和分泌物的核心代謝組。我們建議在以后的研究中通過研究其他物種的分泌物概況并使用與此處應(yīng)用的方法不同的方法來擴(kuò)展核心代謝組的想法。對(duì)存在于根和分泌物中的一組核心化合物的描述可能有助于研究植物-微生物相互作用。根與核心附生菌和內(nèi)生菌相關(guān)，這種相互作用可能部分受存在的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和信號(hào)化合物控制。此外，雖然核心代謝組可能對(duì)與核心微生物組的關(guān)聯(lián)至關(guān)重要，但物種特異性分泌物可能導(dǎo)致與特定微生物的關(guān)聯(lián)。眾所周知，各種微生物具有不同的底物偏好，并且這些偏好是動(dòng)態(tài)的，具體取決于底物可用性和其他微生物的存在。因此，分泌物或組織中特定化合物的存在可能控制著微生物間的相互作用，例如競(jìng)爭(zhēng)或交叉喂養(yǎng)。當(dāng)代謝特征發(fā)生變化時(shí)，例如植物發(fā)育階段、生物或非生物脅迫、微生物群落反應(yīng)。

特定分泌代謝物的功能可以用還原法研究。類似于使用合成菌群作為天然微生物組的代表，可以制作簡(jiǎn)化的分泌物混合物?？梢蕴砑踊騽h除單一代謝物，并改變它們的數(shù)量。然后可以研究微生物群落對(duì)這些合成分泌物的反應(yīng)。此外，合成分泌物可以應(yīng)用于天然土壤中的微生物群落，模擬植物的存在。然后，代謝組學(xué)方法可用于確定根際微生物的底物偏好，并可用于確定哪些微生物更喜歡哪些分泌物。據(jù)報(bào)道，許多化合物會(huì)影響微生物群落的組成。其中包括通才化合物，例如在許多植物物種的分泌物中檢測(cè)到的酚類有機(jī)酸，以及專門化合物，例如分別由擬南芥和禾本科植物分泌的三萜類化合物和苯并惡嗪類化合物，它們可能是更專門的植物-微生物相互作用的原因。

一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)是檢測(cè)到分泌物的晝夜特征，但沒有檢測(cè)到植物組織的晝夜特征。擬南芥在補(bǔ)充蔗糖的條件下生長(zhǎng)3周，僅顯示390個(gè)特征中的7個(gè)晝夜變化。另一項(xiàng)研究顯示25%波動(dòng)的代謝物，擬南芥碳代謝突變體表現(xiàn)出根呼吸的變化，以及從葉子和根中輸出的糖、氨基酸和有機(jī)酸動(dòng)態(tài)的改變。我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)化合物在夜晚結(jié)束時(shí)的豐度低于一天結(jié)束時(shí)的豐度。這可能反映了由于夜間缺乏碳固定，從葉子到根再到根際的代謝物流量較低，可能與夜間水分吸收增加有關(guān)?；蛘咚赡苁钦{(diào)控過程的結(jié)果，可能是由晝夜調(diào)控基因驅(qū)動(dòng)的。微生物組豐度和轉(zhuǎn)錄活性每天都在變化，植物時(shí)鐘基因被證明參與了這一過程。此外，根際土壤有機(jī)質(zhì)晝夜不同。迄今為止尚不清楚分泌減少是否是上述研究中觀察到的微生物組活性和土壤有機(jī)質(zhì)變化的原因。未來的研究可以調(diào)查通過光合作用固定碳、植物內(nèi)的碳運(yùn)輸和進(jìn)入根際的碳之間的聯(lián)系，這取決于其他因素，如蒸騰作用或微生物活動(dòng)。

這里介紹的研究有很多局限性。其中值得一提的是分泌物和組織代謝組學(xué)分析的技術(shù)挑戰(zhàn)。具體而言，本研究側(cè)重于使用正相色譜法分析極性代謝物。眾所周知，與代謝物共洗脫的化合物會(huì)影響它們的電離效率。在這項(xiàng)研究中，我們使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)來部分控制這些影響。此外，我們通過根重對(duì)分泌物進(jìn)行歸一化，這是除了例如通過總碳分泌歸一化之外的常見做法。對(duì)于未來的工作，應(yīng)將本研究中水培植物的分泌物特征與自然環(huán)境（不同土壤、土壤提取物）中生長(zhǎng)的植物進(jìn)行比較，以研究生長(zhǎng)模式（營(yíng)養(yǎng)缺陷型、混合營(yíng)養(yǎng)型）和代謝特征的差異。如果植物能夠在競(jìng)爭(zhēng)中勝過其他生物體，則植物會(huì)從其環(huán)境中吸收大量化合物。研究自然系統(tǒng)分泌的研究因微生物代謝和土壤物理化學(xué)而變得復(fù)雜。此外，植物代謝會(huì)隨著與有益或致病生物（如菌根真菌或青枯菌）的相互作用而發(fā)生顯著變化。大多數(shù)代謝特征的定量和定性變化都沒有得到很好的研究，但對(duì)于確定植物-微生物相互作用的分子機(jī)制至關(guān)重要。朝著這個(gè)方向邁出的第一步是，例如，在先前收集的分泌物中進(jìn)行微生物生長(zhǎng)測(cè)定，以及對(duì)具有活微生物或滅活微生物的植物進(jìn)行處理以確定分泌物的變化。此外，分泌物與土壤顆粒的相互作用對(duì)于確定自然環(huán)境至關(guān)重要。我們得出結(jié)論，生長(zhǎng)和取樣條件是觀察到的分泌曲線的關(guān)鍵決定因素。分泌物是動(dòng)態(tài)的，每天變化，對(duì)于這里調(diào)查的植物物種來說是不同的。盡管如此，還是檢測(cè)到了許多常見的代謝物，這導(dǎo)致了對(duì)根和分泌物核心代謝組的首次描述。

研究方法：

植物生長(zhǎng)條件

二穗短柄草Bd21-3種子在70%乙醇中脫殼并滅菌30秒，然后在6%NaOCl、0.1%TritonX-100中滅菌5分鐘，然后在水中進(jìn)行五步洗滌。幼苗在0.5× Murashige & Skoog平板（0.5× MS, MSP01, Caisson Laboratories, USA; 6% w/v Bioworld Phytoagar, 401000721, Fisher Scientific, USA; pH 5.7）上在16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗條件下發(fā)芽在24°C下放置三天。通過在70%乙醇中培養(yǎng)30分鐘、在無菌水中漂洗4次、在6% NaOCl中培養(yǎng)30分鐘以及在無菌水中漂洗4次，對(duì)蒺藜苜蓿cv Jemalong 種子進(jìn)行滅菌。通過在無菌水中培養(yǎng)4小時(shí)吸收種子，然后在0.5×MS平板上發(fā)芽三天。擬南芥Col-0種子通過在70%乙醇中浸泡15分鐘進(jìn)行滅菌，然后在100%乙醇中浸泡15分鐘，然后干燥。種子在0.5x MS平板上發(fā)芽14天，以避免植物淹沒在罐子里。

Weck罐(743, Glashaus Inc., USA)用MilliQ水沖洗五次，噴灑70%乙醇，在層流罩中用紫外線處理1小時(shí)，并干燥過夜。罐子中裝有150毫升5毫米玻璃珠作為惰性固體基質(zhì)，以保持植物直立，并裝有50毫升0.5× MS（MSP01，Caisson Laboratories，美國(guó)）。對(duì)于0.5MS+suc條件，培養(yǎng)基補(bǔ)充有2% w/v蔗糖（S0389，Sigma-Aldrich，美國(guó)）。實(shí)驗(yàn)對(duì)照罐的設(shè)置完全相同，但它們不含植物。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照罐的處理方式與含有植物的罐相同。二穗短柄草和蒺藜苜蓿的三株幼苗和擬南芥的四株幼苗被轉(zhuǎn)移到每個(gè)罐中。為了在無菌環(huán)境中進(jìn)行氣體交換，將兩條微孔膠帶(56222-182, VWR)放置在罐子開口處，并用微孔膠帶(56222-110, VWR)包裹蓋子。非無菌植物以相同的方式設(shè)置，除了最后一個(gè)微孔帶，以實(shí)現(xiàn)與環(huán)境的氣體交換。植物在16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗條件下在24°C和150 μmol m?2s?1光照下生長(zhǎng)至發(fā)芽后21天，持續(xù)三周。培養(yǎng)基每周更換一次，并在收集根系分泌物的前一天更換。在收集分泌物之前，通過在LB平板上接種50 μl培養(yǎng)基，然后在24°C下培養(yǎng)三天，測(cè)試罐子的無菌性。

根系分泌物采集

將罐中的培養(yǎng)基更換為50 ml 0.5×MS培養(yǎng)基。植物在24°C下以 150 μmol m?2 s?1光照培養(yǎng)兩個(gè)小時(shí)或指定的時(shí)間。分泌物是在中午收集的，除了在一天的最后2小時(shí)收集的日終樣本和在晚上的最后2小時(shí)收集的夜間樣本。在添加蔗糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的植物的根系分泌物也收集在無蔗糖的0.5× MS中，以避免下游LC/MS分析中的離子抑制。通過移液器收集分泌物，通過0.45 μm過濾器（4654，PALL Life Sciences，USA）過濾，在-80°C冷凍，并凍干（Labconco FreeZone 凍干機(jī)）。

植物組織采集

對(duì)于晝夜實(shí)驗(yàn)，擬南芥、二穗短柄草和蒺藜苜蓿的根和莖組織在一天結(jié)束和夜間結(jié)束的時(shí)間點(diǎn)取樣，并立即冷凍在干冰上。用預(yù)稱重的試管記錄組織鮮重，并將樣品儲(chǔ)存在-80°C直至進(jìn)一步處理。

液相色譜樣品制備

將根和莖組織樣本用研磨機(jī)研磨兩次，每次1.5分鐘，頻率 30 s?1。將冷凍樣品轉(zhuǎn)移到冰上，加入1 ml 4 °C LC/MS級(jí)甲醇，渦旋樣品以懸浮材料。通過向空管中加入1 ml LC/MS級(jí)甲醇制備提取對(duì)照。提取對(duì)照的處理方式與樣品相同。將管在冰上培養(yǎng)1小時(shí)，并頻繁渦旋。樣品在10,000 g和 4°C下離心5分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新管中，24℃真空蒸干甲醇。第二次用1ml甲醇在冰上重復(fù)提取，合并樣品的上清液。

將根系分泌物樣品重懸于3 ml LC/MS級(jí)甲醇（CAS 67-56-1，Honeywell Burdick & Jackson，Morristown，NJ，USA）中，渦旋3次，每次10秒，在24℃水浴中超聲處理20分鐘。對(duì)于鹽沉淀，樣品在4°C 下培養(yǎng)16小時(shí)，在5000 g和4°C下離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中，并在24°C下真空蒸發(fā)直至干燥。將樣品重懸于500 μl LC/MS級(jí)甲醇中，并如上所述執(zhí)行第二個(gè)鹽沉淀步驟。

最后，將分泌物和組織樣品重懸于含有15 μM內(nèi)標(biāo)的100% LC/MS級(jí)甲醇中（767964，SigmaAldrich，美國(guó)），體積相對(duì)于組織鮮重。對(duì)于分泌物，使用根鮮重。

代謝組學(xué)分析

使用親水性液體相互作用色譜法對(duì)代謝物進(jìn)行色譜分離，并使用配備HESI-II源探針（ThermoFisher Scientific）的Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于色譜分離，在Agilent 1290系列HPLC系統(tǒng)上使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色譜柱（2.1×150 mm，2.7μm）。內(nèi)部和外部標(biāo)準(zhǔn)包括在內(nèi)質(zhì)量控制目的，在每個(gè)獨(dú)特的樣品之間進(jìn)行空白注射。使用代謝物圖譜(https://github.com/biorack/metatlas) 將LCMS數(shù)據(jù)與內(nèi)部參考標(biāo)準(zhǔn)庫進(jìn)行比較。代謝物鑒定是根據(jù)保留時(shí)間（1分鐘以內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)相比）、裂解光譜（人工檢查）和精確質(zhì)量（20 ppm 以內(nèi)）進(jìn)行的。LC/MS數(shù)據(jù)質(zhì)量是通過分析在運(yùn)行開始、運(yùn)行期間和運(yùn)行結(jié)束時(shí)包含的質(zhì)量控制樣品來確定的。內(nèi)標(biāo)用于評(píng)估峰面積和保留時(shí)間的樣品間一致性。

如果實(shí)驗(yàn)處理的平均強(qiáng)度與實(shí)驗(yàn)空白的平均強(qiáng)度相比相同或更低，則代謝物被排除在分析之外。對(duì)于時(shí)程實(shí)驗(yàn)，另外將樣品與0分鐘控制時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較。此外，代謝物強(qiáng)度表示為最大峰高的百分比，允許樣品之間峰高的相對(duì)比較（例如，如果感興趣的化合物在樣品之間顯著不同），但不能用于絕對(duì)代謝物水平量化（例如化合物的微克每克組織感興趣）。使用 ClassyFire 化合物分類系統(tǒng)將化學(xué)類別分配給代謝物。

統(tǒng)計(jì)分析

為探索實(shí)驗(yàn)條件之間的差異，代謝物譜采用PCA排序，95%置信水平顯示為每個(gè)處理的橢圓。使用python 2.7 Seaborn包執(zhí)行了使用Bray Curtis差異矩陣的層次聚類分析。使用python SciPy ANOVA測(cè)試分析代謝物顯著性水平，并結(jié)合python Tukey的真實(shí)顯著差異測(cè)試，其中p=0.05對(duì)應(yīng)于95%的置信水平。

其他關(guān)鍵信息

• 晝夜實(shí)驗(yàn)收集分泌物，白天最后兩個(gè)小時(shí)，夜晚最后兩個(gè)小時(shí)。

  根系分泌物處理方法：

  0.45微米濾膜， 干冰冷凍，-80°冷凍，冷凍干燥；

  使用LC-MS測(cè)定。

  下一期預(yù)告：NC-三種系統(tǒng)發(fā)育不同植物的核心代謝組和根系分泌物動(dòng)態(tài)（下）：

• 我們看看作者的數(shù)據(jù)究竟是什么樣子？不通過作者的角度進(jìn)行查看，而直面數(shù)據(jù)本身，就是

  就是我文獻(xiàn)超精讀的意義。
  

  

  根際互作生物學(xué)研究室 簡(jiǎn)介