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造血干細(xì)胞（HSCs）可在移植后重建整個(gè)血液和免疫系統(tǒng)，用作多種血液病的治療性細(xì)胞療法，盡管可以從臍帶血中收集，但含量太少，難以成功植入并維持持久的造血重建。人們通常將各種重組細(xì)胞因子添加到人類HSCs培養(yǎng)物中以試圖促進(jìn)HSCs的體外擴(kuò)增，但只支持短期維持。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)通過添加小分子SR-1和UM171可以實(shí)現(xiàn)人HSCs的兩周離體擴(kuò)增，利用這一方法擴(kuò)增的人臍帶血HSCs已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中獲得喜人結(jié)果【1, 2】。2019年，來自東京大學(xué)的Satoshi Yamazaki團(tuán)隊(duì)和斯坦福大學(xué)的Hiromitsu Nakauchi團(tuán)隊(duì)合作在Nature發(fā)文（詳見Bioart報(bào)道：專家點(diǎn)評(píng)Nature | 日本科學(xué)家突破體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞瓶頸可靠嗎？），他們通過一系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn)篩選得到了造血干細(xì)胞體外大量擴(kuò)增的最適條件，該研究成果令不少人激動(dòng)不已。然而，由于這項(xiàng)工作主要利用小鼠HSCs進(jìn)行研究，人HSCs的體外擴(kuò)增效果并不顯著，且代替血清白蛋白的高分子化合物聚乙烯醇（PVA）支持HSCs存活并維持其表型的機(jī)制尚未解釋清楚，因而也有不少權(quán)威專家對(duì)該工作表示出質(zhì)疑。近日，Satoshi Yamazaki團(tuán)隊(duì)和Hiromitsu Nakauchi團(tuán)隊(duì)再度合作在Nature雜志上發(fā)文，題為Chemically defined cytokine-free expansion of human haematopoietic stem cells，他們報(bào)告了一種允許人類HSCs長期離體擴(kuò)增的培養(yǎng)系統(tǒng)，以化學(xué)激動(dòng)劑和基于己內(nèi)酰胺的聚合物完全替代外源性細(xì)胞因子和白蛋白，磷酸肌醇3-激酶激活劑與血小板生成素受體激動(dòng)劑和嘧啶并吲哚衍生物UM171相結(jié)合，足以刺激臍帶血HSCs的擴(kuò)增，這一發(fā)現(xiàn)將有助于推進(jìn)HSCs的臨床治療。在之前的工作中，他們通過優(yōu)化重組干細(xì)胞因子（SCF）和血小板生成素（THPO）的濃度，并用PVA代替血清白蛋白以實(shí)現(xiàn)功能性小鼠HSCs的長期體外擴(kuò)增，但這一系統(tǒng)對(duì)人HSCs的效果有限（小鼠HSPCs增殖約19倍，而人僅3-4倍）【3】。為了確認(rèn)人和小鼠HSPCs增殖產(chǎn)生差異的原因，作者分析了與SCF和THPO相關(guān)信號(hào)通路的磷酸化狀態(tài)，在人類細(xì)胞中觀察到PI3K和AKT的顯著降低，于是他們著手激活PI3K–AKT信號(hào)傳導(dǎo)以改善人類HSPCs的擴(kuò)增。PI3K激活劑740Y-P的添加能明顯提高擴(kuò)增效率，但AKT激動(dòng)劑SC79無此效果?？紤]到之前的工作指出SCF可通過PI3K–AKT–FOXO通路刺激HSCs進(jìn)入細(xì)胞周期，且THPO受體激動(dòng)劑THPO-RAs可用于誘導(dǎo)人類HSC擴(kuò)增【4, 5】，作者用740Y-P和THPO-RAs分別取代SCF和THPO。740Y-P和丁酰胺（THPO-RAs的一種）在7天增殖和GEmM CFU（粒-紅-巨噬-巨核細(xì)胞集落）方面表現(xiàn)出顯著改善，最適濃度為740Y-P 1μM和丁酰胺0.1μM，并將兩者定義為雙激活劑（2a）。需要注意，雖然用2a培養(yǎng)14天細(xì)胞總數(shù)增加，但以CD41+巨核細(xì)胞（MgK）譜系為主。為了解決這個(gè)問題，作者添加兩種已報(bào)道的HSPCs擴(kuò)增化合物SR-1和UM171，發(fā)現(xiàn)UM171(70 nM)、740Y-P(1 μM)和丁酰胺(0.1 μM)的三激活劑(3a)能使HSPCs在30天培養(yǎng)過程中增約14倍，異種移植試驗(yàn)也證明了該體系的體內(nèi)分化潛能。在確認(rèn)了基本的人HSCs培養(yǎng)條件后，該團(tuán)隊(duì)想進(jìn)一步提高HSPCs的離體擴(kuò)增速率，從10種聚合物中篩選出Soluplus（聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物，PCL-PVAc-PEG），并通過體外培養(yǎng)和異種移植試驗(yàn)證實(shí)了基于PCL-PVAc-PEG的3a培養(yǎng)物支持人類HSCs的穩(wěn)健擴(kuò)增，全外顯子組測(cè)序分析進(jìn)一步表明培養(yǎng)過程中發(fā)生的突變不涉及血液惡性腫瘤等，證明了該培養(yǎng)系統(tǒng)的安全性。圖1. 以己內(nèi)酰胺聚合物為基礎(chǔ)的3a培養(yǎng)基支持人造血干細(xì)胞在體外高效擴(kuò)增為了解決HSCs培養(yǎng)物中的細(xì)胞異質(zhì)性，作者對(duì)3a條件或其他兩種基于細(xì)胞因子條件培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析，組間差異顯而易見，簡(jiǎn)單來說，3a培養(yǎng)基中能觀察到高頻率的HSPC-HLF簇和紅細(xì)胞或MgK祖細(xì)胞，而 Mon（單核）和Gra（粒）祖細(xì)胞簇通常被耗盡，培養(yǎng)10天的細(xì)胞的HLF表達(dá)水平高于來自新鮮臍帶血的CD34+細(xì)胞，提示3a系統(tǒng)更適合LT-HSC（長期造血干細(xì)胞）的選擇性擴(kuò)增。最后，該團(tuán)隊(duì)想知道3a培養(yǎng)基是否可以支持克隆衍生的HSCs培養(yǎng)物的擴(kuò)增，將單臍帶血來源的CD34+ CD38- CD90+ CD45RA- CD49f+細(xì)胞分選到96孔板中培養(yǎng)，7天內(nèi)，96孔板中有20個(gè)孔擴(kuò)增超過10倍，11個(gè)孔擴(kuò)增超過30倍，將擴(kuò)增率最高孔內(nèi)的細(xì)胞移植到小鼠中，24周后，10名接受者中有5名表現(xiàn)出強(qiáng)健的外周血、骨髓和脾臟嵌合現(xiàn)象，骨髓和脾臟中多譜系人CD45+嵌合現(xiàn)象超過5%。這些數(shù)據(jù)表明基于PCL-PVAc-PEG的3a培養(yǎng)基可以支持人HSCs離體的大量擴(kuò)增和克隆擴(kuò)增。離體擴(kuò)增臍帶血HSPCs的能力對(duì)于解決供體HSCs短缺問題具有重要意義，這項(xiàng)工作報(bào)告了一種用于長期（至少30天）擴(kuò)增人類HSCs的無重組細(xì)胞因子且無白蛋白的培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有化學(xué)成分確定的優(yōu)勢(shì)，這將改善批次間的差異性，降低試劑成本并促進(jìn)快速臨床轉(zhuǎn)化?？傊?，該培養(yǎng)系統(tǒng)可能對(duì)于對(duì)干細(xì)胞生物學(xué)和HSCs療法感興趣的基礎(chǔ)科學(xué)家和臨床醫(yī)生提供了一個(gè)有用的工具。https://www./articles/s41586-023-05739-9 制版人：十一 1. Boitano, A. E. et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science 329, 1345–1348 (2010).2. Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H. & Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nat. Protoc. 15, 628–648 (2020).3. Wilkinson, A. C. et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature 571, 117–121 (2019).
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