【原】《自然》重磅：干細胞領域圣杯，造血干細胞擴增技術(shù)有望破解

干細胞者說 2023-03-15 發(fā)布于北京

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撰文：步步先生

來源：干細胞者說

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眾所周知，在我們的整個生命周期中，長期存活的造血干細胞（Hematopoietic stem cell ，HSC）能夠分化為幾乎所有類型的血細胞和免疫細胞。幾十億個循環(huán)流通的血細胞并不會在體內(nèi)長期地存活，都是有壽命的。

造血干細胞和她的孩子們

基于干細胞的“自我更新”特點，僅僅很少數(shù)量的造血干細胞就能產(chǎn)生人體一生當中所需的所有血細胞，堪稱四兩撥千斤。然而到目前為止，研究人員一直都無法在實驗室中培養(yǎng)出足夠數(shù)量的功能造血干細胞。造血干細胞的擴增，一直是干細胞領域的圣杯！

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造血干細胞擴增重大突破

2023年2月22日，國際頂級期刊Nature 一篇論文中，來自東京大學和斯坦福大學的研究團隊發(fā)表一篇題為 Chemically defined cytokine-free expansion of human haematopoietic stem cells 的文章，發(fā)明了一種化學成分明確且無細胞因子的培養(yǎng)體系，成功在實驗室中長期穩(wěn)定地培養(yǎng)出人源造血干細胞。

截圖來自nature

文章顯示：研究者通過用化學小分子組合替換了重組干細胞因子（SCF）和促血小板生成素（TPO），開發(fā)了一種無細胞因子培養(yǎng)體系。這種培養(yǎng)體系支持臍血造血干細胞的體外大量擴增并能保持其功能性，同時也支持造血干細胞的克隆擴增，解決了造血干細胞在體外擴增培養(yǎng)的瓶頸。

培養(yǎng)體系的核心成分是：740Y-P（一種PI3K激活劑），UM171（一種HSPC擴增化合物）和丁酰胺（一種TPO受體激動劑），同時使用Soluplus（聚乙烯醇己內(nèi)酰胺-聚乙烯醇-聚乙二醇接枝共聚物，即PCL-PVAc-PE）替代PVA。這個培養(yǎng)體系中不需要使用血清，不需要細胞因子，化學成分明確。對于這個新的造血干細胞培養(yǎng)體系，我們將其中幾個關(guān)鍵問題一一做下解析：

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解析一：化學成分明確的無細胞因子培養(yǎng)基

結(jié)合前期研究，重組干細胞因子（SCF）和促血小板生成素（TPO）、聚乙烯醇 (polyvinyl alcohol，PVA) 組合的培養(yǎng)基適合造血干細胞生長。在這種培養(yǎng)條件下，小鼠造血干/祖細胞（HSPCs）可迅速擴增，而人類造血干細胞的擴增很有限。而造成這種差異的原因是人類細胞中PI3K和AKT通路活性顯著降低。

圖1.一種化學成分明確的無細胞因子培養(yǎng)基能在體外維持人類HSPCs

使用化學激動劑740Y-P（PI3K激活劑）使PI3K磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)不管有無SCF的存在，740Y-P都能促進HSPCs的增殖，這表明：SCF可以被740Y-P 所替代。同樣，TPO可以被丁酰胺（TPO受體激動劑）取代。不過，2a無細胞因子培養(yǎng)基（由740Y-P和丁酰胺組成）只能短期支持人造血干細胞的擴增。

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解析二：長期的體外造血干細胞培養(yǎng)

由UM171（70nM）、740Y-P（1μM）和丁酰胺（0.1μM）組成的三激活劑（3a）培養(yǎng)基是最適合造血干細胞生長的。在這種條件下，人造血干細胞連續(xù)培養(yǎng)到30天，可持續(xù)增殖14倍。將其進行異種移植16周和24周后發(fā)現(xiàn)，在小鼠外周血、骨髓、脾臟中觀察到較高的細胞嵌合率（CD34+、CD45+）。結(jié)果表明：人造血干/祖細胞可以在3a培養(yǎng)基中穩(wěn)定增長，可以在體外維持功能至少一個月。

圖2.人類HSPCs在3a培養(yǎng)基中長期體外擴增

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解析三：己內(nèi)酰胺聚合物改善造血干細胞的生長

在建立無細胞因子培養(yǎng)體系后，使用 Soluplus（即聚乙烯醇己內(nèi)酰胺-聚乙烯醇-聚乙二醇接枝共聚物，PCL-PVAc-PE）替代PVA，并在培養(yǎng)30天后觀察到總細胞的大約75倍擴增， CD34+細胞的55倍擴增。異種移植實驗發(fā)現(xiàn)在小鼠外周血、骨髓和脾臟中，都觀察到類似的、穩(wěn)健的人類細胞嵌合。這表明：基于PCL-PVAc-PEG 的3a培養(yǎng)體系的細胞實現(xiàn)了體外大量擴增，具有體外功能并且可移植。

圖3. 己內(nèi)酰胺聚合物的3a培養(yǎng)基支持人類HSCs的體外高效擴增

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解析四：造血干細胞長期選擇性擴增培養(yǎng)

通過流式細胞術(shù)對造血干細胞表面標記物進行分析。結(jié)果表明：經(jīng)過3a培養(yǎng)體系長期培養(yǎng)后，CD34+EPCR+CD90+CD45RA?ITGA3+細胞在培養(yǎng)7天后顯著富集，表明造血干細胞表型顯著富集。經(jīng)全外顯子組測序結(jié)果表明，有7個可能導致氨基酸發(fā)生變化的突變，有4個剪接位點的突變，但與血液系統(tǒng)惡性腫瘤或克隆造血無關(guān)。結(jié)果表明：3a培養(yǎng)體系是安全的。

圖4. 3a培養(yǎng)基長期選擇性擴增功能性人類HSCs

造血干細胞培養(yǎng)存在異質(zhì)性問題。研究團隊發(fā)現(xiàn)PCL-PVAc-PEG的3a培養(yǎng)體系的造血干細胞中，HSPC-HLF細胞群、紅細胞系和MgK祖細胞群比例更高，而單核細胞群和粒細胞祖細胞群則更少。結(jié)果表明，3a培養(yǎng)體系具有更低的異質(zhì)性，更適合長期造血干細胞（Long-term HSCs , LT-HSCs）的選擇性擴增。

最后，3a培養(yǎng)體系是否能支持克隆衍生的造血干細胞擴增培養(yǎng)。結(jié)果表明，50%的受試小鼠在24周后表現(xiàn)出了良好的外周血、骨髓和脾臟嵌合，骨髓和脾臟中有超過5%的多系人類CD45+嵌合率。結(jié)果表明，3a培養(yǎng)體系支持造血干細胞的克隆擴增。

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回顧總結(jié)

研究結(jié)果顯示，研究者通過用化學小分子組合（UM171+740Y-P+丁酰胺）替換了造血干細胞經(jīng)典培養(yǎng)基中的重組干細胞因子（SCF）和促血小板生成素（TPO），開發(fā)出一種無細胞因子培養(yǎng)體系，該體系支持臍血造血干細胞的體外大量擴增并能保持其功能性，適合長期造血干細胞的選擇性擴增，同時也支持造血干細胞的克隆擴增，解決了造血干細胞在體外擴增培養(yǎng)的瓶頸。

如果這套培養(yǎng)體系可以成功規(guī)?；囵B(yǎng)臨床級人源造血干細胞，它可能會為再生醫(yī)學和基礎研究做出巨大的貢獻。

主要參考文獻：

https://www./articles/s41586-023-05739-9