| 酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT）是1983年由Gzerkinsky等根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗而建立的一種體外檢測單細(xì)胞水平特異性抗體分泌細(xì)胞功能的免疫學(xué)新技術(shù)。T-SPOT是結(jié)核菌感染T細(xì)胞斑點試驗，用于檢測結(jié)核菌感染后特異性T細(xì)胞分泌的γ干擾素（INF-γ），并根據(jù)此結(jié)果判斷是否感染核。2001年，Lalvani首先將ELISPOT技術(shù)用于結(jié)核病的診斷，此后相關(guān)報道日益增多。據(jù)WHO（世界衛(wèi)生組織）統(tǒng)計，全世界有超過1/3的人曾經(jīng)感染過結(jié)核分支桿菌，《2012年全球結(jié)核病報告》顯示，在2011年有870萬新發(fā)病例，140萬人死于結(jié)核病，而且這個數(shù)字逐年增加。我國是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，發(fā)病率僅次于印度，耐多藥結(jié)核病患病人數(shù)高居全球第1位，因結(jié)核感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)是其他傳染病總死亡率的2倍以上。而且，結(jié)核病的表現(xiàn)形式多種多樣，并可累及全身各組織、器官，除了毛發(fā)、指（趾）甲外，幾乎均可受感染。由于結(jié)核病(尤其是肺外結(jié)核)的早期病變比較隱匿，給臨床診斷帶來極大地困難，而且這一類患者通過常規(guī)胸片，CT，痰涂片鏡檢可能查不到病變及細(xì)菌，這就有可能成為潛在傳染源而危害公眾健康安全。目前結(jié)核分枝桿菌的主要檢測方法有結(jié)核菌素（PPD）皮試，結(jié)核菌涂片、染色和鏡檢，分枝桿菌分離培養(yǎng)，組織病理學(xué)檢查，結(jié)核抗體檢測，結(jié)核蛋白芯片，結(jié)核菌PCR檢測等。臨床數(shù)據(jù)顯示，不同的檢測方法對結(jié)核分枝桿菌感染的檢出率均有一定的效果，但同時也發(fā)現(xiàn)有假陽性反應(yīng)或受標(biāo)本的影響（如應(yīng)該留晨痰標(biāo)本的結(jié)果留的是唾液）而出現(xiàn)假陰性的情況。既往的結(jié)核菌素實驗（PPD皮試）是長期以來用以快速診斷結(jié)核菌感染的唯一手段，但在普遍接種PPD的地區(qū)存在有“假陽性”情況，而且對于結(jié)果的判讀存在有人為誤差的可能。對于因HIV感染等免疫功能低下的患者可能還有無反應(yīng)性的結(jié)果，這就如同感染了乙肝病毒變異株而用常規(guī)的ELISA方法檢測不到乙肝病毒一樣。因此，需要尋找一個更加敏感而且快速的方法來診斷結(jié)核菌感染。分子生物學(xué)方法以其簡便、快速、特異性高的特點成為結(jié)核分枝桿菌檢測研究的熱點。國內(nèi)外大量研究證明PCR檢測結(jié)核分枝桿菌敏感性達(dá)到100%。但采用熒光PCR對待檢測樣本中遇到病灶排菌量少，或處于排菌間歇期，則無法檢測到樣本中的結(jié)核分枝桿菌，故菌陰結(jié)核的檢測需要聯(lián)合其他方法才能確診。這有點類似于用定性PCR檢測不到乙肝病毒（HBV）而通過定量方法才能發(fā)現(xiàn)HBVDNA，與其有“異曲同工”之妙。T-Spot.TB技術(shù)于2004年在歐洲，2005年在加拿大被批準(zhǔn)使用，美國FDA于2008年審批用于臨床診斷。它是以ELISPOT技術(shù)檢測結(jié)核菌的一種新方法，相當(dāng)于檢測HBV的斑點雜交技術(shù)，可以檢測出1/100000~1/500000外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中經(jīng)抗原刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子，用ELISPOT分析系統(tǒng)進(jìn)行斑點計數(shù)，從而計算出抗原特異性細(xì)胞出現(xiàn)的頻率。由于結(jié)核菌感染后會長期存在記憶性T細(xì)胞（即使康復(fù)后也可能存在），當(dāng)再次受到抗原的刺激后，能迅速活化增殖，并且釋放γ干擾素，這樣通過檢測γ干擾素的活性就可反推是否感染結(jié)核菌。臨床實踐證明，T-Spot具有快速、敏感和良好的特異性。有癥狀的結(jié)核病通?？梢酝ㄟ^痰涂片及培養(yǎng)，影像學(xué)診斷而確診，但對肺外結(jié)核的診斷比較困難（特別是針對兒童），而且對于潛伏性結(jié)核（即沒有臨床癥狀，胸片或CT掃描正常，傳統(tǒng)PPD試驗陰性，痰檢等均為陰性者）用傳統(tǒng)的方法無法確診，使得部分患者成為“隱性傳染源”而危害公眾健康。由于血清學(xué)檢測方面，試劑的靈敏度低，不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染患者，2011年7月20日，WHO發(fā)表正式聲明，要求禁止將血清學(xué)檢測方法（抗原、抗體、蛋白芯片等）用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷。T-Spot技術(shù)利用效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核菌抗原刺激時會分泌特異性細(xì)胞因子的原理，檢測結(jié)核菌感染比其他方式更加靈敏，并且可用于結(jié)核菌潛伏感染的診斷，因此被列入美國、英國等歐美20多個國家結(jié)核病診療指南，而且美國CDC推薦將此項檢測列為BCG（卡介苗）接種人群結(jié)核菌感染的首選檢測方法。結(jié)核潛伏感染人群（LTBI）是一個龐大的結(jié)核病源庫，是結(jié)核難以控制的根源所在。ELISPOT試驗檢測結(jié)核分枝桿菌抗原特異性T淋巴細(xì)胞，能夠早期準(zhǔn)確提供結(jié)核感染的證據(jù)，為兒童結(jié)核病臨床診斷增加了一個診斷方式，對于臨床診斷困難的不典型病例、臨床急、危重癥病例、營養(yǎng)不良患兒以及其他處于免疫抑制狀態(tài)的患兒，ELISPOT試驗將會是輔助診斷兒童結(jié)核病的較佳選擇。診斷靈敏度達(dá)80%，特異性86%。該檢查的優(yōu)點：1.特異性95%左右，不受卡介苗接種與環(huán)境分支桿菌的影響2.靈敏度95%左右，幾乎不受個體免疫功能低下的影響3.快速檢測，24小時內(nèi)可報告結(jié)果4.斑點數(shù)的意義：斑點越多越傾向于活動性結(jié)核、現(xiàn)癥感染，并可作為療效監(jiān)測指標(biāo)。國內(nèi)文獻(xiàn)報告，T-Spot檢測結(jié)核的靈敏度為94.7%，在肺疾病組和肺外疾病組分別為95.6%和93.3%；特異性為84.1%，在肺疾病組和肺外疾病組分別為69.2%和88.9%。大量臨床實踐證明，T-Spot是診斷結(jié)核感染方面具有良好敏感性和特異性的方法，在鑒別活動性結(jié)核和潛伏結(jié)核感染，預(yù)測結(jié)核發(fā)病風(fēng)險方面具有重要的意義，目前的檢測技術(shù)其標(biāo)本已不局限于痰、靜脈血，在支氣管肺泡灌洗液、胸腹水、腦脊液等也可用于肺結(jié)核及肺外結(jié)核的診斷，有的認(rèn)為用其他體液標(biāo)本檢測的靈敏度還顯著高于外周血標(biāo)本，這樣就為肺外結(jié)核病的診斷增加了一個快速確診的方式。正如采用PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）及定量技術(shù)檢測HBVDNA及/或HCVRNA用來判斷HBV及/或HCV感染一樣，T-SPOT逐漸成為在結(jié)核病診斷領(lǐng)域中具有革命性的方法而受到推崇并成為首選檢測方法。 |
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