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促貼壁物質(zhì)和包被方法詳解

 小夢想在努力 2023-02-19 發(fā)布于北京

許多細(xì)胞必須添加促貼壁物質(zhì)才能貼壁生長,
促貼壁物質(zhì)一般為細(xì)胞外基質(zhì),
如纖連蛋白、層粘連蛋白等。
不同細(xì)胞外基質(zhì)對細(xì)胞粘附的效果一樣嗎?
細(xì)胞外基質(zhì)的包被濃度是什么標(biāo)準(zhǔn)?
今天我們就來扒一扒
那些常見的促貼壁物質(zhì)和包被方法~

膠原蛋白(Collagen)

是支持細(xì)胞和組織生長的重要胞外基質(zhì)蛋白,其形成的胞外環(huán)境有利于多種細(xì)胞的粘附、生長、遷移和分化。I型膠原可促進(jìn)正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的貼壁和增殖。膠原主要包括I型膠原,Ⅱ型膠原,Ⅲ型膠原,Ⅳ型膠原,Ⅴ型膠原,Ⅵ型膠原幾種。

I型膠原——最常見的膠原蛋白,促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和增殖,用于內(nèi)皮細(xì)胞,肝細(xì)胞,肌細(xì)胞等的培養(yǎng)。

軟骨細(xì)胞對II型膠原的黏附性較好;上皮細(xì)胞在Ⅳ型膠原底物上貼壁良好,而在I、II、III型膠原底物的培養(yǎng)板上貼壁情況較差。

膠原應(yīng)用及建議細(xì)胞基質(zhì)濃度:

纖粘連蛋白(Fibronectin,F(xiàn)N)

一種位于細(xì)胞表面和血漿中的大分子蛋白質(zhì),是一種主要的細(xì)胞黏附分子,在細(xì)胞纖維基質(zhì)中發(fā)揮結(jié)構(gòu)和黏附性作用。
建議以1-5ug/cm2或者 0.5-50ug/ml的濃度作為細(xì)胞基質(zhì),但最佳濃度取決于細(xì)胞類型或研究目的、應(yīng)用方向。
BI也提供Fibronectin solution(貨號: 03-090-1),可參考如下方法包被:

(1) 19ml 無菌的PBS加1ml的纖連蛋白 (濃度50ug/ml);
(2) 之后一個T25 (表面積25 cm2)需用2.5ml包被, 所以視使用情形分裝包被;
(3) 一個T25加2.5ml纖連蛋白溶液;
(4) 放4度至少30分鐘;
(5) 吸出纖連蛋白溶液;
(6) 用無菌的PBS潤洗一次, 即可培養(yǎng)細(xì)胞。

層粘連蛋白(Laminin)
是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成,存在于所有上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的基底側(cè),同時也是某些細(xì)胞與細(xì)胞間交互作用的中間媒介。層粘連蛋白有細(xì)胞及組織特異性,對于調(diào)節(jié)細(xì)胞功能具有重要作用,如:協(xié)助粘附、促進(jìn)生長、引導(dǎo)遷移、調(diào)控分化、維持表型、防止細(xì)胞凋亡等。
在哺乳動物胚胎中,Laminin-521和511是最早表達(dá)的胞外蛋白,在2-4細(xì)胞期,已經(jīng)可以檢測到。LN-111支持hPSCs高效,符合GMP標(biāo)準(zhǔn)地分化為均一的多巴胺(DA)前體細(xì)胞。相比擬胚體(EB)為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)方案,DA前體細(xì)胞的產(chǎn)量在LN-111上增加40倍以上。
層粘連蛋白,根據(jù)不同細(xì)胞系,包被濃度一般為5-20μg/ml。

BioLamina人類重組層粘連蛋白:化學(xué)成分限定,無異源動物成分。
使用1×DPBS(Ca2+/Mg2+)稀釋,并將包被溶液加入到培養(yǎng)皿中,確保包被溶液覆蓋整個培養(yǎng)皿表面,2-8℃孵育過夜或37℃孵育2小時。
 
玻璃粘連蛋白(Vitronectin)
屬于小分子蛋白,借由Vitronectin 受體讓細(xì)胞貼附于細(xì)胞基質(zhì)中,主要促進(jìn)細(xì)胞遷移,增加細(xì)胞貼附性、細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長分化等,并協(xié)助細(xì)胞間的訊號傳遞。
BI重組玻璃粘連蛋白 Vitronectin ACF Human Recombinant  200 μg(05-754-0002)
使用濃度0.5mg/ml,預(yù)包被濃度:0.5μg/cm2
 建議按如下濃度包被,適用于培養(yǎng)hPSC:
1.在冰上解凍重組玻連蛋白。
2.加入3ml /孔(6孔盤)NutriStemV9 XF 培養(yǎng)基。
3.在37℃的CO2培養(yǎng)箱中放置至少30分鐘。
4.加入5-7.5μl玻連蛋白ACF到3ml NutriStemV9 XF培養(yǎng)基中并旋轉(zhuǎn)。注意:也可以在NutriStem?V9 XF培養(yǎng)基中直接添加玻連蛋白ACF(濃度:0.25-0.375μg/cm2)。

MSC 促貼壁試劑
MSC促貼壁試劑是Biological industries產(chǎn)品,搭配MSC NutriStem XF Medium使用,效果更佳。MSC促貼壁試劑針對多種來源的hMSC(骨髓,脂肪組織和臍帶)特別開發(fā)。
特點(diǎn):
·  無異源體系 
· 適用于多種來源的MSC細(xì)胞貼壁
· 即用型,100倍濃縮液
· 適用于無血清體系
· 適用hMSC增殖和誘導(dǎo)分化試劑

可參考如下包被方法:
1.使用DPBS溶液,將MSC貼壁試劑稀釋100倍(1:100)。
2.加入適量的1XMSC貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板;包被期間, 注意包被液不可以干掉!
3.輕輕搖動培養(yǎng)皿,確認(rèn)貼壁試劑均勻分布在培養(yǎng)皿表面后,用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿。
4.在2-8℃孵育過夜;或者在CO2培養(yǎng)箱,37℃,至少孵育30分鐘。
5.接種前, 吸除貼壁試劑,再用DPBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿,即可接種細(xì)胞。

使用MSC Attachment solution后,MSC貼壁效果:


 



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