? 細(xì)胞遷移與侵襲實驗有什么區(qū)別？

細(xì)胞遷移是細(xì)胞在化學(xué)信號（如：趨化因子）的驅(qū)使下沿著濃度梯度從一個區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一區(qū)域的運動。損傷修復(fù)、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育以及惡性腫瘤轉(zhuǎn)移等諸多生理/病理過程都需要通過細(xì)胞遷移來完成。

細(xì)胞侵襲與細(xì)胞遷移比較類似，但是“侵襲”需要細(xì)胞穿過胞外基質(zhì)層（ECM）或基底膜基質(zhì)層（BME），在這個過程中細(xì)胞先酶解去除ECM/BME的阻礙，從而在趨化因子濃度梯度驅(qū)使下完成從一處到另一處的移動。細(xì)胞侵襲可以發(fā)生在正常細(xì)胞的炎癥反應(yīng)過程中，也常發(fā)生在惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中。因此，研究其中的機制對多種生理/病理過程都有著重要的意義。

? 遷移、侵襲實驗的大致步驟是怎樣的？

Corning的Transwell小室產(chǎn)品（以及我司旗下Falcon品牌的Insert小室產(chǎn)品）可為遷移、侵襲實驗構(gòu)建絕佳的研究模型。您可將待研究的細(xì)胞接種在Transwell/Insert小室的微孔膜上，在上下室分別加入含有不同濃度的趨化因子的培養(yǎng)基；細(xì)胞在遷移、侵襲實驗時，受到趨化因子的吸引，會擠壓自身以穿過膜上的小孔，并在膜的背側(cè)貼附下來。實驗結(jié)束后，您可統(tǒng)計穿過膜的細(xì)胞的情況來評價遷移/侵襲實驗。

與遷移實驗不同的是，侵襲實驗中需要在微孔膜上額外包被一些基質(zhì)蛋白（ECM/BME），如膠原、纖粘蛋白、層粘連蛋白等，CorningMatrigel產(chǎn)品也被非常廣泛地應(yīng)用在侵襲實驗中。

? 如何選擇用于遷移/侵襲實驗的產(chǎn)品？

Corning品牌Transwell小室主要的兩種膜材質(zhì)聚碳酸酯（Polycarbonate, PC）和聚酯（Polyesteror Polyethylene Terephthalate，PET）均可用于遷移、侵襲實驗。

Falcon品牌的Insert產(chǎn)品膜材質(zhì)均為聚酯（PET）。

兩種材質(zhì)的主要區(qū)別在光透性方面，即PC膜半透明，不太方便在培養(yǎng)的過程中觀察上室細(xì)胞的形態(tài)；PET膜透明，方便在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)。您可根據(jù)是否有需要觀察細(xì)胞狀態(tài)來挑選膜材質(zhì)。請注意Falcon品牌的Insert產(chǎn)品膜材質(zhì)雖然均為聚酯（PET），但是針對孔密度的不同而分為透明膜及半透明膜兩種。

在膜孔徑的選擇方面，需要根據(jù)您所研究的細(xì)胞種類來決定，下表為一些常見細(xì)胞種類進行遷移、侵襲實驗的孔徑推薦，供您參考，同時也可以參考已發(fā)表的相關(guān)文獻來輔助您的判斷。目前我司提供的小室產(chǎn)品最大孔徑為8um，能夠滿足大多數(shù)較大細(xì)胞（如多數(shù)腫瘤細(xì)胞）遷移、侵襲實驗的需求。（對于一些要求嚴(yán)格的實驗，我們建議在正式實驗前選取一系列孔徑進行預(yù)實驗來確定最適合于您的細(xì)胞培養(yǎng)和特殊應(yīng)用的尺寸。）

在進行侵襲實驗時，如選用Matrigel來進行小室的包被，在沒有特殊要求的情況下（如：酚紅不會影響您的實驗和后續(xù)檢測），標(biāo)準(zhǔn)濃度的Matrigel產(chǎn)品便可滿足您的需要。（如Corning貨號356234—5ml規(guī)格/354234—10ml規(guī)格。如您的研究涉及生長因子及其相關(guān)信號通路，您可選擇生長因子減量型GFRMatrigel。）由于侵襲實驗中需要用到的Matrigel終濃度并不高（一般為200-300ug/ml），高濃度的Matrigel產(chǎn)品非常粘稠，在稀釋時容易造成濃度不準(zhǔn)確，可能會影響您的實驗結(jié)果，因此不推薦使用高濃度Matrigel產(chǎn)品進行侵襲實驗。

我司亦有預(yù)包被了Matrigel 的小室產(chǎn)品出售，Corning? BioCoat? Matrigel? Invasion Chamber 354480/354481/354483。 

? 在進行細(xì)胞侵襲實驗時，如何包被小室？

準(zhǔn)備包被小室的Matrigel可使用冰上預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基或phosphate-bufferedsaline (PBS), pH 7.4稀釋（關(guān)于Matrigel的使用您可參考Matrigel相關(guān)技術(shù)文檔）。大多數(shù)情況下，您可使用培養(yǎng)實驗細(xì)胞的同種培養(yǎng)基（無血清）。

我司推薦的Matrigel包被濃度為200～300ug/ml。不同板式的小室包被量可參考下表：

您可根據(jù)您的細(xì)胞種類、侵襲能力等優(yōu)化Matrigel包被濃度，并通過預(yù)實驗進行驗證。在稀釋到所需濃度后，您可使用預(yù)冷的吸頭將Matrigel稀釋液加入小室中，再將小室連同接收板一并放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中1～2小時，包被即完成。由于侵襲實驗所需要的Matrigel稀釋液終濃度不會大于Matrigel的成膠濃度，因此，包被完成后，您并不會觀察到小室內(nèi)有一厚層果凍狀的凝膠。您可將小室稍稍傾斜，用吸頭小心吸去上室內(nèi)多余的包被液（請勿觸碰小室底部，以免破壞膜上包被好的Matrigel）。包被好的小室即可接種細(xì)胞了。推薦您在包被的當(dāng)天使用包被好的小室。

? 水化（Rehydration）是個什么步驟？我需要對包被好的小室進行“水化”嗎？

水化步驟僅適用于預(yù)包被Matrigel的侵襲小室產(chǎn)品，Corning? BioCoat? Matrigel? Invasion Chamber 354480/354481/354483。在將預(yù)包被Matrigel的侵襲小室從冰箱中取出，除去包裝并平衡到室溫后，您需要向小室內(nèi)和接收板的孔中加入溫?zé)岬臒o血清培養(yǎng)基（加液體積請參考下表），在37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中水化約2小時。之后，請小心去除多余的培養(yǎng)基（請勿觸碰小室底部，以免破壞膜上包被好的Matrigel）。

如果您是自行包被的小室，包被好的小室即可接種細(xì)胞，不需要進行額外的“水化”步驟。

? 我需要在小室內(nèi)接種多少細(xì)胞？

這需要根據(jù)您使用的細(xì)胞種類和狀態(tài)進行優(yōu)化，下表為我司的推薦用量，供您參考，您可在推薦量上下設(shè)計梯度以選取最適合您實驗的細(xì)胞接種數(shù)量。

? 遷移/侵襲實驗需要進行多長時間？

在許多情況下，遷移實驗所需的時間相對侵襲實驗短，可能數(shù)小時便可得到所需結(jié)果，而侵襲實驗一般需要相對長的時間，如24小時、甚至48小時。但是遷移/侵襲實驗所需的時間與多方面因素有關(guān)，如誘導(dǎo)因子的種類、濃度，細(xì)胞的性質(zhì)，基質(zhì)蛋白屏障的包被濃度和“用量“（僅針對侵襲實驗）等。因此，進行預(yù)實驗來優(yōu)化遷移/侵襲實驗時間非常關(guān)鍵。

需要注意的是，遷移實驗的孵育時間越長，細(xì)胞自發(fā)進行轉(zhuǎn)移的情況會相應(yīng)增多；另外，如果實驗進行的時間過長，也需要考慮細(xì)胞生長狀態(tài)以及增殖的因素，這些都會影響實驗的結(jié)果。

? 在遷移/侵襲實驗孵育結(jié)束后，應(yīng)進行哪些操作？

首先棄去小室內(nèi)的液體，接著，您可使用培養(yǎng)基或PBS濕潤過的棉簽傾斜著擦拭小室膜的上層，以去除未發(fā)生遷移/侵襲的細(xì)胞。當(dāng)棉簽頭在膜表面移動時，請對膜施加輕柔但持續(xù)的壓力。請小心操作，勿破壞膜和小室結(jié)構(gòu)，同時，由于小室膜底部與接收板的距離并不大，請您留意勿使膜接觸孔底，破壞遷移/侵襲到背側(cè)的細(xì)胞。隨后，使用第二支棉簽重復(fù)擦拭并用洗液洗滌上室。

如您采用染色的方式檢測實驗結(jié)果，您可在擦拭過后使用常見的多種細(xì)胞固定液和染色試劑，或是商品化的試劑盒，對穿膜的細(xì)胞進行固定和染色的操作。請您依據(jù)相應(yīng)試劑供應(yīng)商的使用說明進行操作。最后，將小室風(fēng)干，便可以在顯微鏡下觀察、計數(shù)細(xì)胞。

? 為何我在鏡下觀察到穿膜細(xì)胞的分布在膜周圍一圈和（或）膜中間與其他位置有明顯不同？

在一些情況下，某些細(xì)胞確實會傾向于從周圍和/或中間部位遷移，因此造成在這些區(qū)域的穿膜細(xì)胞相對其他區(qū)域密集。您可以盡可能選取多個視野，并設(shè)置平行復(fù)孔，以獲得能更“準(zhǔn)確”代表細(xì)胞遷移/侵襲情況的數(shù)據(jù)。

此外，如果出現(xiàn)區(qū)塊間細(xì)胞分布過于懸殊的狀況，可能有其他原因，如細(xì)胞接種不均勻，包被的Matrigel層被部分破壞，擦拭細(xì)胞或其他操作時的誤損傷等。

? 實驗結(jié)果應(yīng)如何統(tǒng)計？

您可根據(jù)多個視野內(nèi)遷移/侵襲細(xì)胞計數(shù)，鏡下視野的大小以及膜面積，折算出單個小室膜上發(fā)生遷移/侵襲的細(xì)胞量，與總接種細(xì)胞量比較，得到單個小室的遷移/侵襲率。之后可繼續(xù)進行您的各個處理組內(nèi)及組間的計算和比較。

此外，在侵襲實驗中，推薦您設(shè)置一組未包被胞外基質(zhì)的”遷移組“，作為整個侵襲系統(tǒng)的參照。亦可計算各處理組發(fā)生侵襲的細(xì)胞平均數(shù)與參照組發(fā)生遷移的細(xì)胞平均數(shù)的比值作為侵襲率的統(tǒng)計方式。

? 小室的膜可以封片保存嗎？

可以。您可使用鋒利的手術(shù)刀片沿著膜與小室側(cè)壁連接的邊緣將膜切下，請在即將完全切下時留下很小的附著點，使用鑷子從小室上將膜取下，將其底部向下放置在已滴好一小滴浸鏡油（或其他封片試劑）的載玻片上，接著再在膜上滴一小滴浸鏡油，覆上另一塊載玻片或是蓋玻片，輕輕施加一定壓力以驅(qū)趕氣泡。

? 懸浮細(xì)胞是否可進行遷移/侵襲實驗？

可以。懸浮細(xì)胞在誘導(dǎo)因子的趨使下穿過膜上的孔后會落至下室。您可以收集接收板內(nèi)的細(xì)胞，使用血球計數(shù)儀，流式細(xì)胞儀或其他染色的方式（如MTT，熒光染色等）進行計數(shù)。

? 在侵襲實驗結(jié)束后，我在鏡下完全觀察不到穿膜的細(xì)胞，請問是怎么回事？

侵襲實驗不成功的原因可能有很多種，除了誤操作以外，以下一些可能的方面供您參考：

• 是否選擇了正確的孔徑；

• 是否選擇了正確的誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)因子的使用濃度是否足夠有效；（不少情況下您可通過預(yù)先饑餓細(xì)胞，以增強其對于誘導(dǎo)因子如血清的敏感程度。）

• 是否設(shè)有系統(tǒng)對照；（如未包被的遷移組，遷移組的結(jié)果可幫助分析侵襲實驗不成功的原因。）

• 細(xì)胞狀態(tài)是否正常，是否有過研究表明其具有侵襲能力；

• 細(xì)胞接種密度是否合適；

• 胞外基質(zhì)蛋白屏障的選擇是否合適，包被濃度是否過高；（如您使用了較高濃度的Matrigel進行包被，甚至大于其成膠濃度3mg/ml，在包被結(jié)束后能觀察到膜表面鋪有一厚層果凍狀的凝膠，則很大可能會由于細(xì)胞侵襲能力有限無法成功穿膜。）

• 加液時有否在膜下形成氣泡；（氣泡會對實驗結(jié)果產(chǎn)生很大影響，您可在孵育開始后幾小時再觀察一次，以確認(rèn)膜下沒有小氣泡匯聚形成大氣泡。）

? 我可以使用其他的計數(shù)遷移/侵襲細(xì)胞的方法嗎？

除了染色和顯微鏡下計數(shù)以外，您可以使用多種試劑分離細(xì)胞并計數(shù)；或使用染色、脫色、檢測脫色液的OD值的方式間接反映細(xì)胞數(shù)；亦可使用鈣黃綠素等多種熒光染料對細(xì)胞染色后在讀板機上讀取熒光值（需使用FluoroBlok小室）。