嘉峪檢測網(wǎng) 檢驗檢測學(xué)習(xí)圈 2022-12-31 05:00 發(fā)表于遼寧上一篇： 實驗員逃不過的色譜知識——色譜總論、氣相色譜56個核心知識點(上)
上下兩篇文章共分為了四個部分：色譜法總論、氣相色譜法、高效液相色譜法、質(zhì)譜分析法，共涉及了104個色譜分析的相關(guān)知識點，內(nèi)容都是干貨適合收藏反復(fù)查閱。 與氣相色譜法相比，液相色譜法不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性及相對分子質(zhì)量的限制，只要求把樣品制成溶液即可，非常適合于分離生物大分子、離子型化合物，不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物以及其他各種高分子化合物等。此外，液相色譜的流動相不僅起到使樣品沿色譜柱移動的作用，而且與固定相一樣，與樣品分子發(fā)生選擇性的相互作用，這就為控制和改善分離條件提供了一個額外的可變因素。而氣相色譜法采用的流動相是惰性氣體，對組分沒有親和力，僅起運載作用。高壓、高速、高效、高靈敏度、高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。 高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。低壓脫氣法(電磁攪拌、水泵抽空，可同時加熱或向溶劑吹氮氣)、吹氦氣脫氣法和超聲波脫氣法等。用兩種(或多種)不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序連續(xù)改變流動相中溶劑的配比和極性，通過流動相中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。特點是先加壓后混合，將溶劑用高壓泵增壓以后輸入色譜系統(tǒng)的梯度混合室，加以混合后送入色譜柱。特點是先混合后加壓。在常壓下預(yù)先按一定的程序?qū)⑷軇┗旌虾笤儆帽幂斎肷V柱。良好的密封性，最小的死體積，最好的穩(wěn)定性，進樣時對色譜系統(tǒng)壓力、流量影響較小。色譜柱是實現(xiàn)分離的核心部件。由柱管和固定相組成。柱管為直型不銹鋼管。一般色譜柱長5~30cm，內(nèi)徑4~5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3~12mm，而制備色譜柱內(nèi)徑則可達25mm。一般淋洗溶劑在進入色譜分離柱之前，先通過前置柱。HPLC柱的填料顆粒粒徑一般約為3~10m，填充常采用勻漿法，色譜柱的發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。作用——用來連續(xù)監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。紫外-可見吸收檢測器、光電二極管陣列檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器。流動相不與色譜柱發(fā)生不可逆化學(xué)變化，以保持柱效或柱子的保留性質(zhì)較長時間不變;對待測樣品有足夠的溶解能力；與所用檢測器相匹配；粘度盡可能小，以獲得較高的柱效；流動相純度要高，價格便宜，毒性小。以二氧化硅為基質(zhì)，可承受較高壓力，表面可鍵合各種功能官能團——鍵合固定相，是目前應(yīng)用最廣泛的固定相。主要用于離子交換色譜法和凝膠色譜法中，由聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯(lián)而成，可承受的壓力較低。表面多孔型：基體是球形玻璃珠，在玻璃表面涂覆一層多孔活性物質(zhì)如硅膠、氧化鋁、聚酰胺、離子交換樹脂、分子篩等。優(yōu)點：適用于快速分離、填充均勻緊密、機械強度高、能承受高壓，適于簡單的樣品及常規(guī)分析；由硅膠顆粒聚集而成，比表面積大，柱容量大，小顆粒全孔型固定相孔洞淺傳質(zhì)速率快，柱效高，分離效果好，適合于復(fù)雜樣品、痕量組分的分離分析，是目前HPLC中應(yīng)用最廣泛的固定相。是以固體吸附劑為固定相，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力，試樣分子被流動相帶入柱內(nèi)時，它將與流動相溶劑分子在吸附劑表面發(fā)生競爭吸附。分離過程是一個吸附-解吸的平衡過程。通常是硅膠、氧化鋁、活性炭等固體吸附劑，硅膠最常用；流動相：極性大的試樣需用極性強的洗脫劑，極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。應(yīng)用：幾何異構(gòu)體分離和族分離，如農(nóng)藥異構(gòu)體；石油中烷、烯、芳烴的分離。不適于強極性的離子型樣品的分離，不適于分離同系物(因為，它對相對分子質(zhì)量的選擇性較小)。根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶(或部分互溶)的液體中溶解度的不同實現(xiàn)分離，分配系數(shù)較大的組分保留值也較大。流動相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者二者的極性相差越大越好。根據(jù)流動相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜(流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于強極性和中等極性組分分離)和反相分配色譜(流動相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性或弱極性組分分離)。由載體和固定液組成。常用的固定液有b，b’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鯊?fù)榈取?/span>例：分離水解蛋白質(zhì)所生成的各種氨基酸，分離脂肪酸同系物等。化學(xué)鍵合固定相是利用化學(xué)反應(yīng)將有機分子鍵合到載體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成各種性能的固定相。固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命較高；能耐受各種溶劑，可用于梯度洗脫；表面較為均一。沒有液坑，傳質(zhì)快，柱效高；能鍵合不同基團以改變其選擇性。例如，鍵合氰基、氨基等極性集團用于正相色譜法，鍵合離子交換基團用于離子色譜法，鍵合C2、C4、C6、C8、C18、C16、C18、C22烷基和苯基等非極性基團用于反相色譜法等。因此，它是HPLC較為理想的固定相。離子交換色譜法的固定相是離子交換樹脂，流動相是水溶液，它是利用待測樣品中各組分離子與離子交換樹脂的親和力的不同而進行分離的。水的緩沖溶液，陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；凝膠色譜法的固定相為多孔性凝膠類物質(zhì)，流動相為水溶液或有機溶劑，它是根據(jù)不同組分分子體積的大小進行分離的。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質(zhì)量在100～105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。能溶解樣品且與凝膠相似(潤濕凝膠并防止吸附作用)、粘度小(增加擴散速度)。常用四氫呋喃、苯、氯仿、水等。(1)液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍左右，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。(3)液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。(4)恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。(5)流速大于0.5cm/s時, H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。(6)氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。 是將待測物質(zhì)置于離子源中電離形成帶電離子，讓離子加速并通過磁場或電場后，離子將按質(zhì)荷比(m/z)大小分離，形成質(zhì)譜圖。依據(jù)質(zhì)譜線的位置和質(zhì)譜線的相對強度建立的分析方法稱為質(zhì)譜法。根據(jù)碎片特征進行化合物的結(jié)構(gòu)分析。質(zhì)譜法是利用電磁學(xué)原理，將待測樣品分子解離成具有不同質(zhì)量的離子，然后按其質(zhì)荷比(m/z)的大小依次排列收集成質(zhì)譜。根據(jù)質(zhì)譜中的分子離子峰(M+)可以獲得樣品分子的相對分子質(zhì)量信息；根據(jù)各離子峰(分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰等)及其相對強度和氮數(shù)規(guī)則，可以確定化合物的分子式;根據(jù)各離子峰及物質(zhì)化學(xué)鍵的斷裂規(guī)律可以進行定性分析和結(jié)構(gòu)分析；根據(jù)組分質(zhì)譜峰的峰高與濃度間的線性關(guān)系可以進行定量分析。（2）離子化，在電離室，組分分子被一束加速電子碰撞，撞擊使分子電離形成正離子；（4）荷正電離子被加速電壓V加速，產(chǎn)生一定的速度v，與質(zhì)量、電荷及加速電壓有關(guān)；（5）加速正離子進入一個強度為B的磁場(質(zhì)量分析器)，發(fā)生偏轉(zhuǎn)。真空系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、離子源或電離室、質(zhì)量分析器、離子檢測器。是減少離子碰撞損失，若真空度低：大量氧會燒壞離子源的燈絲；會使本底增高，干擾質(zhì)譜圖；引起額外的離子-分子反應(yīng)，改變裂解模型，使質(zhì)譜解釋復(fù)雜化；干擾離子源中電子束的正常調(diào)節(jié)；用作加速離子的幾千伏高壓會引起放電等。高效重復(fù)地將樣品引入到離子源中并且不能造成真空度的降低；間歇式進樣系統(tǒng)——氣體及低沸點、易揮發(fā)的液體;直接探針進樣——高沸點的液體、固體；色譜進樣系統(tǒng)——有機化合物。作用是使試樣中的原子、分子電離成離子，其性能影響質(zhì)譜儀的靈敏度和分辨率本領(lǐng)。70eV；加一小磁場增加電離幾率；EI源電離效率高,碎片離子多，結(jié)構(gòu)信息豐富，有標(biāo)準(zhǔn)化合物質(zhì)譜庫；結(jié)構(gòu)簡單，操作方便；樣品在氣態(tài)下電離，不能汽化的樣品不能分析，主要用于氣-質(zhì)聯(lián)用儀；有些樣品得不到分子離子。電離能小，質(zhì)譜峰數(shù)少，譜圖簡單；最強峰為(M+1)+準(zhǔn)分子離子峰；不適用難揮發(fā)試樣。高能量的Xe原子轟擊涂在靶上的樣品，濺射出離子流。本法適合于高極性、大分子量、低蒸汽壓、熱穩(wěn)定性差的樣品，F(xiàn)AB一般用作磁式質(zhì)譜的離子源。特點：ESI是最軟的一種電離方式，只產(chǎn)生分子離子，不產(chǎn)生碎片離子；適用于強極性，大分子量的樣品分析，如，肽，蛋白質(zhì)，糖等；產(chǎn)生的離子帶有多電荷，尤其是生物大分子；主要用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，既用作液相色譜和質(zhì)譜儀之間的接口裝置，同時又是電離裝置。分子離子峰強；碎片離子峰少；不適合化合物結(jié)構(gòu)鑒定。準(zhǔn)分子離子峰很強且碎片離子少。通常用于飛行時間質(zhì)譜，特別適合測定多肽、蛋白質(zhì)、DNA片段、多糖等的相對分子質(zhì)量。將離子源產(chǎn)生的離子按質(zhì)荷比m/z的大小分開。離子的m/z與R，B，V有關(guān)。通過改變磁場可以把不同離子分開。在一定磁感應(yīng)強度B下，改變加速電壓V可以使不同離子先后通過檢測器，實現(xiàn)質(zhì)量掃描，得到質(zhì)譜。特點：結(jié)構(gòu)簡單，操作方便；只有方向聚焦，無能量聚焦，分辨率低。對于動能不同的離子，通過調(diào)節(jié)電場能，達到聚焦的目的。特點：結(jié)構(gòu)簡單，體積小、重量輕，掃描速率快，適合與色譜聯(lián)機。特點：質(zhì)量范圍寬，掃描速率快，既不需磁場也不需電場，只需要直線漂移空間。特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達檢測器。特點：結(jié)構(gòu)簡單、易于操作、靈敏度高。質(zhì)譜一般可用線譜或表譜兩種方法表示，常用線譜；線譜上的各條直線表示一個離子峰，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比m/z，縱坐標(biāo)為離子的相對強度(相對豐度)，一般將原始質(zhì)譜圖上最強的離子峰定為基峰并定為相對強度100%，其他離子峰以對基峰的相對百分值表示。能夠很直觀地觀察到整個分子的質(zhì)譜全貌；質(zhì)譜表是用表格形式表示的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，質(zhì)譜表中有兩項即質(zhì)荷比及相對強度，對定量計算較直觀。分辨率(R)指質(zhì)譜儀能區(qū)別鄰近兩個質(zhì)譜峰的能力，對兩個相等強度的相鄰峰，當(dāng)兩峰間的峰谷不大于其峰高10%時，則認(rèn)為兩峰已經(jīng)分開。分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰。分子離子峰的m/z相當(dāng)于該化合物的相對分子質(zhì)量。一般除同位素離子峰外，分子離子峰是質(zhì)譜圖中最大質(zhì)荷比的峰，位于質(zhì)譜圖的最右端。(1)分子離子峰必須符合氮數(shù)規(guī)則：有機化合物含有偶數(shù)個氮原子或不含氮原子，分子離子峰的m/z一定是偶數(shù);含奇數(shù)個氮原子，分子離子峰的m/z一定是奇數(shù)；(2)分子離子峰與相鄰離子峰的質(zhì)量差應(yīng)合理，如，不可能出現(xiàn)比分子離子峰質(zhì)量小4～13個質(zhì)量單位的峰； (3)當(dāng)化合物中含S，Br，Cl時，可利用M+(M2+)+等同位素離子峰的比例來確認(rèn)分子離子峰。 (4)改變質(zhì)譜儀的操作條件，提高分子離子峰的相對強度。 ※采用化學(xué)電離源或降低電子轟擊源電壓可獲得較強的M+峰。 25.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀： 質(zhì)譜：純物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。 色譜：化合物分離，定性能力差。 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：共同優(yōu)點，GC-MS、LC-MS、CE-MS，色譜是質(zhì)譜的進樣及分離系統(tǒng)，質(zhì)譜是色譜的檢測器。 主要問題：接口技術(shù)，除去色譜中大量的流動相分子。 適用范圍：適用于揮發(fā)度低、難氣化、極性強、相對分子質(zhì)量大及熱穩(wěn)定性差的樣品。 26.無損檢測定義： 無損檢測技術(shù)即非破壞性檢測，就是在不破壞待測物質(zhì)原來的狀態(tài)、化學(xué)性質(zhì)等前提下，為獲取與待測物的品質(zhì)有關(guān)的內(nèi)容、性質(zhì)或成分等物理、化學(xué)情報所采用的檢查方法。
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