本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種西馬特羅半抗原、抗原及其化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒與應用。

背景技術(shù)：

西馬特羅(cimaterol，cim)，分子式c12h17n3o，屬于一種β-受體激動劑。在醫(yī)學上，西馬特羅能調(diào)節(jié)交感神經(jīng)興奮、松弛氣管平滑肌，因此常用于治療哮喘。此外，研究表明，西馬特羅將對動物體內(nèi)的營養(yǎng)進行再分配，促進蛋白質(zhì)沉積而抑制脂肪形成，從而顯著提高動物的瘦肉率。在動物生產(chǎn)中，存在非法添加西馬特羅的現(xiàn)象。西馬特羅在動物體內(nèi)代謝緩慢、作用時間久、性質(zhì)穩(wěn)定、藥物殘留率高，通過動物體內(nèi)長期蓄積與組織中，對食用者的身體健康造成較大的危害，甚至威脅生命安全。西馬特羅作為新型“瘦肉精”物質(zhì)，檢測手段滯后，尤其缺乏快速檢測產(chǎn)品。

國家標準中檢測西馬特羅的主要方法有高效液相色譜法(hplc)和氣相色譜法(gc)。采用色譜法進行檢測，成本高，耗時長，要達到較高的靈敏度，通常需要加大樣品稱取量，而氯霉素樣品前處理多采用有機試劑萃取，蒸干后復溶的方式，加大樣品量意味著萃取劑用量相應提高，從而使前處理操作更為繁瑣，消耗時間延長，而且因設(shè)備和維護費用高昂，而且對儀器操作員的技術(shù)要求較高，不適用于現(xiàn)場檢測和監(jiān)控，如cn103675145a。色譜法盡管能達到大部分檢測要求，但無法應對大量樣品現(xiàn)場快速檢測的需求，因而通常作為確證方法。而免疫分析法具有成本低、操作簡單、速度快、一次檢測樣本量大、儀器化程度低等特點。因此在食品安全檢測中，往往先用免疫分析方法進行初篩后，再對陽性樣本用hplc或gc進行確證。

中國專利文獻cn103630689a公開了一種檢測西馬特羅藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法與應用，采用重氮化法合成西馬特羅人工完全抗原，該elisa方法雖具有簡單、快速、靈敏的特點，也適宜大規(guī)模的篩查工作，但其靈敏度有一定的制約。因此建立一種經(jīng)濟、方便、可靠、特異、敏感、快速、準確的定量檢測動物性食品中西馬特羅的方法，具有相當?shù)谋匾??；瘜W發(fā)光免疫分析法是將化學反光體系與免疫反應相結(jié)合，用于檢測微量抗原或抗體的一種標記免疫測定技術(shù)。其檢測原理是：固相載體表面的抗原和樣品中相應抗原競爭性地與抗體結(jié)合，再加入酶標二抗形成抗原抗體酶標復合物，最后洗滌加入發(fā)光底物酶促發(fā)光，通過檢測發(fā)光強度值，而抗原濃度與發(fā)光強度值呈負相關(guān)。此方法的突出優(yōu)點為靈敏度高，線性動力學范圍寬，光信號持續(xù)時間長，分析方法簡便快速，結(jié)果穩(wěn)定、誤差小，安全性好且使用期長。相比儀器分析方法的優(yōu)勢表現(xiàn)在：能實現(xiàn)大批量現(xiàn)場檢測，且更經(jīng)濟、省時。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種西馬特羅半抗原。該半抗原具有準確、靈敏、快速、能夠高通量檢測西馬特羅的優(yōu)點，為西馬特羅快速檢測產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的理論指導，對食品安全監(jiān)控具有重要意義。

本發(fā)明的第二個目的是提供應用上述西馬特羅半抗原制備得到的西馬特羅抗原。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述西馬特羅抗原在制備西馬特羅特異性抗體中的應用。

本發(fā)明的第四個目的是提供應用上述西馬特羅抗原制備得到的西馬特羅特異性抗體及其制備方法。

本發(fā)明的第五個目的是提供上述西馬特羅特異性抗體在檢測西馬特羅中的應用。

本發(fā)明的第六個目的是提供應用上述西馬特羅抗原、西馬特羅特異性抗體制備得到的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種西馬特羅半抗原，為式(i)所示化合物：

本發(fā)明還公開了式(i)所示化合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

將西馬特羅與4-溴丁烯酸加入n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶劑中，攪拌溶解后加入無水碳酸鉀，50～60℃磁力攪拌反應2～4h；分離純化，即可得到西馬特羅半抗原。

進一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，所述西馬特羅、4-溴丁烯酸與無水碳酸鉀的質(zhì)量比為2～4：2～3：4～6。

更進一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，所述西馬特羅、4-溴丁烯酸與無水碳酸鉀的質(zhì)量比為3.5：2.86：5。

本發(fā)明提供的西馬特羅抗原，是將式(i)所示化合物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。

常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)、人血清白蛋白(hsa)、鼠血清白蛋白(msa)、甲狀腺蛋白(tg)或血藍蛋白(klh)等。其中，牛血清白蛋白(bsa)的效果最佳。

本發(fā)明還公開了所述西馬特羅抗原的制備方法，包括如下步驟：

s1.取西馬特羅半抗原0.1～0.5mmol溶于n,n-二甲基甲酰胺中，邊攪拌邊加入二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)各0.2～1.0mmol，4～8℃下攪拌反應12～24h，離心取上清，得到西馬特羅半抗原反應液；

s2.將載體蛋白溶0.1～0.3mol/lpbs中，得到載體蛋白溶液；

s3.攪拌條件下，將西馬特羅半抗原反應液逐滴加入載體蛋白溶液中，4～8℃攪拌反應過夜；

s4.離心取上清液，用pbs于4℃條件透析2～3d，期間每天換液2～3次，得到西馬特羅抗原。

所述西馬特羅抗原可以作為免疫原制備西馬特羅特異性抗體，也可以作為包被原制備化學發(fā)光酶標板。

應用西馬特羅抗原制備得到的特異性抗體具體可為單克隆抗體或多克隆抗體。

所述西馬特羅抗原、所述特異性抗體均可應用于檢測西馬特羅。

本發(fā)明還公開了應用所述西馬特羅抗原、所述特異性抗體制備得到的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。

所述化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括：包被有西馬特羅抗原的化學發(fā)光酶標板、西馬特羅抗體、酶標二抗、西馬特羅標準溶液、化學發(fā)光液和洗滌液。

進一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，所述西馬特羅抗原為西馬特羅與牛血清白蛋白(bsa)的偶聯(lián)物，所述西馬特羅抗原的包被濃度為10～46.67μg/l。

進一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，西馬特羅抗原的包被液由1.69～2gna2co3和2.95～4gnahco3溶于1～1.5l去離子水中得到。

進一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，所述化學發(fā)光酶標板為可拆不透明白色發(fā)光板。

所述化學發(fā)光酶標板是96孔可拆不透明酶標板，材質(zhì)為聚苯乙烯，包被有能與抗西馬特羅抗體特異性結(jié)合的西馬特羅抗原，并封閉微孔表面未吸附西馬特羅抗原的位點。

所述包被有西馬特羅抗原的化學發(fā)光酶標板的制備方法為：用包被液將西馬特羅抗原按需要稀釋，向發(fā)光板微孔中加入包被液，放入37℃環(huán)境進行孵育過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌，然后在每孔中加入封閉液，37℃孵育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。

另外，可以作為固定西馬特羅抗原固相載體的物質(zhì)較多，例如聚苯乙烯、硝酸纖維素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)葡萄糖、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等均可作為固定西馬特羅抗原固相載體。該載體的形式可以為凹孔、紙片、小珠等。

進一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，所述化學發(fā)光液由a液和b液組成，a液為將20mg對碘苯酚、8mg魯米諾、1.21gtris溶于100ml去離子水，用鹽酸調(diào)ph至8.4得到；b液為將體積分數(shù)0.40％h2o2、1.21gtris溶于100ml去離子水，用鹽酸調(diào)ph至7.0得到；使用時，將a液和b液按體積比1：1的比例混合。

進一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，所述洗滌液為20倍濃縮洗滌液，為含有體積濃度0.5％tween20的ph為7.4的0.4mol/l的磷酸鹽緩沖液；使用時用去離子水稀釋成1倍洗滌液。

進一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，所采用的酶標二抗為1.00mg/ml羊抗鼠igg二抗，工作濃度為0.67g/ml。

進一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，所采用的封閉液為將0.10g牛血清白蛋白(bsa)、5.00g甘氨酸、5.00g蔗糖溶于100mlpbs(0.01mol/lph7.4)溶液得到。

進一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，所述西馬特羅標準溶液在使用時用0.01mol/l、ph6.50的磷酸緩沖液(pb)將標準品溶液稀釋成濃度為的一系列0.00μg/l、0.10μg/l、0.30μg/l、0.90μg/l、2.70μg/l、8.10μg/l西馬特羅標準溶液。

更進一步地，在本發(fā)明較佳的實施例中，所述磷酸緩沖液(pb)的配方為：分別稱取2.90gnah2po4·12h2o和0.20gnah2po4，并加入去離子水定容至1l。

所述西馬特羅的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測范圍為0.10～8.10μg/l，靈敏度0.51μg/l，檢出限為0.10μg/l，回收率為80.81％～127.80％。

本發(fā)明還提供了所述西馬特羅化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法，包含如下步驟：

s1.將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于15～35℃平衡30～45min；

s2.取出化學發(fā)光酶標板，往標準孔中加入不同濃度的西馬特羅標準溶液，樣品孔中加入待測樣品，然后每孔加入酶標二抗，再加入西馬特羅抗體，蓋上蓋板膜振搖混勻，37℃孵育15min；

s3.吸除板孔中的反應液，用稀釋后20倍的洗滌液進行洗滌5次，將酶標板拍干；所述洗滌液為濃縮洗滌液稀釋20倍得到；

s4.每孔加入化學發(fā)光液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，3min后測定各孔的發(fā)光強度值(rlu)；

s5.檢測結(jié)果的計算與分析：確定樣品中西馬特羅的含量。

抑制率(％)＝b/b0×100(％)，式中：b為不同濃度西馬特羅的標準品溶液孔或待測樣品孔的rlu；b0為0濃度西馬特羅標準品溶液的rlu；

以抑制率為縱坐標，西馬特羅濃度的對數(shù)為橫坐標繪制標準曲線，從而確定樣品中西馬特羅的含量。

s2所述的待測樣品可以為雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等組織樣品、以及飼料或尿液等樣品。

優(yōu)選地，s2所述的待測樣品為動物尿樣。

待測樣品為動物尿樣時，其前處理方法如下：

取澄清透明的動物尿樣待測，混作尿樣則先4000～5000r/min離心5～10min后，再取上清液以待測。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1.本發(fā)明所述西馬特羅的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測范圍為0.10～8.10μg/l，靈敏度0.51μg/l，檢出限為0.10μg/l，回收率為80.81％～127.80％。該試劑盒檢測快速、大大縮短了檢測時間，不考慮檢測人員技術(shù)水平的影響，整個檢測過程僅僅需要20min左右即可完成，且檢出限更低、靈敏度更高。同時，采用包被抗原的包被板大大提升了試劑盒的穩(wěn)定性和精密度，檢測更穩(wěn)定、更準確。

2.高靈敏度、高特異性：與現(xiàn)有的西馬特羅的elisa試劑盒相比，克服了試劑盒檢測過程中易受到內(nèi)源性酶干擾、吸光度的檢測也易受到多種外在因素的影響的弊端，本發(fā)明采用高特異性、高親合力的抗體，檢測西馬特羅的化學發(fā)光酶免疫試劑盒靈敏度更高，可達到0.51μg/l。

3.另外，本發(fā)明所述試劑盒采用化學發(fā)光方法，不使用elisa試劑盒中的濃硫酸等有強腐蝕性的試劑、以及有強致癌性的底物，更加環(huán)保安全；且操作簡單、成本低，適合大量樣品或現(xiàn)場篩查的痕量分析與批量檢測，具有重要的實際應用推廣意義。

附圖說明

圖1為西馬特羅化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的標準曲線。

圖2為西馬特羅半抗原合成路線。

具體實施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。

實施例1西馬特羅半抗原的制備

稱取3.50mg西馬特羅與2.86mg4-溴丁烯酸加入10mldmf溶劑中，攪拌溶解后加入5mg無水碳酸鉀，60℃磁力攪拌反應2h，將反應之后的溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后，柱色譜純化，即可得到西馬特羅半抗原cim-ca。

對所得的西馬特羅半抗原進行質(zhì)譜和核磁共振氫譜鑒定，[m+h]⁺＝304.2；結(jié)果顯示，西馬特羅半抗原合成成功，為式(i)所示化合物：

實施例2西馬特羅人工抗原、包被原及特異性抗體的制備

(1)西馬特羅人工抗原的制備

取上述西馬特羅半抗原0.10mmol溶于0.50mldmf中，邊攪拌邊加入dcc和nhs各0.20mmol，4℃下磁力攪拌反應12h，離心取上清，得到西馬特羅半抗原反應液；稱取載體蛋白bsa溶于4.00ml的0.10mol/lpbs(ph8.00)中，得到載體蛋白溶液；攪拌條件下，將西馬特羅半抗原反應液緩慢逐滴加入到載體蛋白溶液，4℃攪拌過夜；離心取上清液，用pbs于4℃下透析3d，每天換液2次，得到人工抗原(即免疫原)，分裝凍存于-20℃，備用。

(2)西馬特羅包被原的制備

方法同人工抗原的制備方法。

(3)西馬特羅單克隆抗體的制備

采用上述人工抗原免疫3只6～8周齡的雌性balb/c小鼠。先將免疫原用生理鹽水稀釋成1.00mg/ml，按每只小鼠注射100ml的劑量，分別免疫4次。首次免疫加完全弗氏佐劑，皮下多點注射；兩周后進行第二次免疫，免疫原加不完全弗氏佐劑，同樣皮下多點注射進行加強免疫。此后每兩周加強免疫一次，在第四次免疫后一周對小鼠進行剪尾收集血清，并使用elisa測定抗血清滴度。在細胞融合前3d對產(chǎn)生最高滴度抗血清的小鼠進行加強免疫，直接腹腔注射0.50ml相應抗原(不加佐劑)。以10:1的比例將免疫小鼠的脾細胞與sp2/0骨髓瘤細胞融合，并在37℃，5％co2條件下的hat培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在融合后約7d后，用間接競爭elisa選擇和標記效價高、抑制率高的陽性雜交瘤細胞。陽性細胞經(jīng)有限稀釋法亞克隆3次均為100％的陽性后，建立細胞株并凍存。并將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔，制備腹水，使用proteing親和層析法純化單抗備用。

(4)包被原濃度與抗體濃度的優(yōu)選

1).將7.00mg/ml的西馬特羅抗原按照不同倍數(shù)稀釋(如1:50000、1:100000、1:150000、1:200000)，并縱向按150μl/孔包被至不透明白色發(fā)光板，4℃孵育過夜，用洗滌液洗滌兩次，吸水紙上拍干。

2).加入封閉液170μl/孔進行封閉，37℃過夜，甩干放入烘箱。

3).加入50μl/孔pbs稀釋的不同梯度的西馬特羅標準品溶液。

4).加入50μl/孔酶標二抗，再加入50μl/孔用pbs稀釋的不同梯度的西馬特羅單克隆抗體(1:10000、1:50000、1:100000、1:150000)，37℃孵育15min，洗板5次，吸水紙上拍干。

5).每孔分別加入化學發(fā)光液a液和b液各50μl，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，3min后用化學發(fā)光免疫分析儀測定各孔的發(fā)光值rlu。以發(fā)光值隨包被原濃度有明顯梯度變化的包被抗原濃度和抗體稀釋濃度為最佳濃度進行特異性測定。得到包被原最佳濃度為46.67μg/l，抗體稀釋倍數(shù)為100000倍。

(5)抗體靈敏度的測定

以包被濃度為包被原最佳濃度為46.67μg/l，西馬特羅單克隆抗體稀釋100000倍后，進行抗體靈敏度的測定。

1).取96孔不透明白色發(fā)光板，將包被原用稀釋液稀釋至46.67μg/l，每孔加入150μl，4℃孵育過夜，用洗滌液洗滌兩次，吸水紙上拍干

2).加入170μl/孔封閉液進行封閉，37℃過夜，甩干放入烘箱。

3).加入50μl/孔pb稀釋的不同梯度的西馬特羅標準品溶液。

4).依次加入50μl/孔酶標二抗和50μl/孔100000倍稀釋的西馬特羅抗體，37℃孵育15min，洗板5次，吸水紙上拍干。

5).每孔分別加入化學發(fā)光液a液和b液各50μl，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，3min后用化學發(fā)光免疫分析儀測定各孔的發(fā)光值rlu。

6).結(jié)果以抑制率計算，抑制率(％)＝b/b0×100(％)，b為不同標準濃度溶液競爭的發(fā)光值，b0為不加標準品的發(fā)光值，計算ic50為0.51μg/l，即西馬特羅單克隆抗體的靈敏度。

實施例3西馬特羅化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的制備

(1)準備試劑

1)包被有西馬特羅抗原的酶標板：96孔可拆酶標板，包被西馬特羅抗原及封閉液，包被濃度為0.05mg/l。所述西馬特羅抗原為西馬特羅半抗原cim-ca與bsa的偶聯(lián)物。

將包被抗原用包被液稀釋至46.67μg/l，每孔內(nèi)加入150μl包被液，4℃孵育過夜，傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌2次，拍干。然后每孔中加入170μl封閉液，37℃孵育3h，傾去孔內(nèi)液體，置于37℃烘箱中烘干后，用鋁箔袋真空密封4℃保存。

2)西馬特羅標準品溶液的配制：準確稱取西馬特羅標準品溶液，用色譜級甲醇稀釋成1.00mg/ml，再用0.01mol/lpb緩沖液(配方為2.90gnah2po4·12h2o、0.20gnah2po4，定容至1l)分別配制0.00μg/l、0.10μg/l、0.30μg/l、0.90μg/l、2.70μg/l、8.10μg/l西馬特羅溶液，4℃保存。

3)西馬特羅單克隆抗體濃度為6.00mg/ml；其工作濃度為1:100000，用pbs進行稀釋。

4)化學發(fā)光液：由a液和b液組成；使用時將a液和b液按體積比1:1的比例混合。a液的配制方法為：將20.00mg對碘苯酚、8.00mg魯米諾、1.21gtris溶于100ml去離子水，用鹽酸調(diào)ph至8.50；b液的配制方法為：將體積分數(shù)0.40％h2o2、1.21gtris溶于100ml去離子水，用鹽酸調(diào)ph至7.00。

5)20倍濃縮洗滌液；使用時用去離子水稀釋成1倍洗滌液。

6)酶標二抗的配置：1.00mg/ml羊抗鼠igg二抗稀釋至0.67g/ml。

(2)試劑分裝

將各試劑測定合格后無菌分裝，已稀釋的西馬特羅標準品系列溶液lml/瓶，西馬特羅抗體7ml/瓶，酶標二抗7ml/瓶，化學發(fā)光液a液7ml/瓶，化學發(fā)光液b液7ml/瓶，20倍濃縮洗滌液50ml/瓶。分裝后貼標簽，注明批號和有效期，4℃保存。

(3)試劑盒的組裝

分別將上述包被有西馬特羅抗原的化學發(fā)光酶標板1塊，西馬特羅抗體、酶標二抗、化學發(fā)光液a液、化學發(fā)光b液、20倍濃縮洗滌液各1瓶，西馬特羅標準品溶液6瓶和使用說明書1份置于試劑盒內(nèi)指定位置，試劑盒檢驗合格后封裝，4℃保存。

實施例4西馬特羅化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的應用

(1)利用本發(fā)明實施例3的試劑盒進行檢測

1)取出實施例3的試劑盒，置于室溫(20～24℃)平衡30min以上，

2)取出化學發(fā)光酶標板，在標準孔加入50μl不同濃度的標準品溶液，樣品孔加入50μl待測樣品，然后每孔加入50μl酶標二抗，再加入50μl西馬特羅抗體，蓋上蓋板膜在微量振蕩器上振搖10min后，置于37℃孵育15min。

3)吸除板孔中的反應液，各孔加入洗滌液約300μl，靜置20s左右，除去其中液體，如此共洗5次，最后一次將板拍干；也可用自動洗板機洗板5次，洗完后將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每輪洗板拍打3次)，以保證完全除去孔中的液體。

4)每孔分別加入化學發(fā)光液a液和b液各50μl，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，3min后用化學發(fā)光免疫分析儀測定各孔的發(fā)光值rlu，保存數(shù)據(jù)。

(2)檢測結(jié)果計算與分析

抑制率(％)＝b/b0×100(％)，式中：b為不同濃度西馬特羅的標準品溶液孔或待測樣品孔的發(fā)光值；b0為0濃度西馬特羅標準品溶液發(fā)光值；以抑制率為縱坐標，西馬特羅濃度的對數(shù)為橫坐標繪制標準曲線，以樣品孔的吸光值代入上述標準曲線中求出待測樣品中西馬特羅的含量。不考慮檢測人員操作熟練程度的影響，整個檢測過程僅僅需要20min內(nèi)即可完成。檢測結(jié)果的分析還可以利用計算機專業(yè)軟件進行計算與分析。

(3)標準曲線

通過對標準品溶液的檢測結(jié)果分析得到西馬特羅標準曲線圖(如附圖1所示)，表明了本發(fā)明試劑盒對西馬特羅的線性檢測范圍為0.10～8.10μg/l，靈敏度為0.51μg/l，檢出限為0.10μg/l。

實施例5西馬特羅化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的應用評價

(1)試劑盒靈敏度和檢測限

按照常規(guī)方法測定試劑盒靈敏度，標準曲線的范圍為0.00～8.10μg/l，ic50的浮動范圍為0.46～0.89μg/l；對20份樣品進行檢測，從標準曲線上查出對應于各百分吸光度值的濃度，以20份樣本濃度的平均值加上3倍標準差表示檢測限，結(jié)果顯示，該方法對動物尿樣的檢測限均為0.10μg/l。

(2)準確度和精密度試驗

向不含西馬特羅的動物尿樣中添加西馬特羅標準品，使西馬特羅標準品在樣品中的終濃度分別為0.50μg/l、1.00μg/l、3.00μg/l，將添加后的樣品分別按照上述方法進行前處理，得到檢測樣本溶液。從三個不同批次的試劑盒中各抽取3個試劑盒進行檢測，檢測方法如上所述，每個實驗重復4次，分別計算變異系數(shù)。其中：

1)以回收率作為準確度評價指標，其計算公式為:樣品的添加濃度回收率的計算方法:平均回收率(rg)＝測定值與真實值的比值×100％。

2)變異系數(shù)的計算方法:變異系數(shù)(cv)＝(各平行樣本的標準差與各平行樣本平均值的比值)×100％；其中批內(nèi)變異系數(shù)的計算方法:批內(nèi)cv＝同一次測定中各平行樣本的變異系數(shù)，取其平均值；批間變異系數(shù)的計算方法:批間cv＝同一樣本在不同批次測定結(jié)果的變異系數(shù)，取其平均值。

3)結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明:本發(fā)明的試劑盒的平均回收率在之間；批內(nèi)、批間相對標準偏差均小于20％。

表1準確度和精密度試驗結(jié)果

(3)試劑盒保存期的試驗

1)將實施例3的試劑盒放置于2～8℃，分別取放置0、2、4、6、8、9、10、11和12個月的試劑盒，對西馬特羅標準樣品的發(fā)光值、ic50、添加回收率、批內(nèi)變異系數(shù)各參數(shù)進行測定。

2)將試劑盒在37℃保存的條件下放置12天，每天對西馬特羅標準樣品的發(fā)光值、ic50、添加回收率、批內(nèi)變異系數(shù)各參數(shù)進行測定。

3)將試劑盒在-20℃冰箱保存12天，每天對西馬特羅標準樣品的發(fā)光值、ic50、添加回收率、批內(nèi)變異系數(shù)各參數(shù)進行測定。

結(jié)果表明，經(jīng)過三種條件保存試驗，該試劑盒各項指標完全符合要求，因此，從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2～8℃保存12個月。

從以上結(jié)果可得出，本發(fā)明的試劑盒可以在2～8℃至少可以保存一年。

(4)交叉反應率試驗

選擇與西馬特羅結(jié)構(gòu)或功能相似的其他藥物進行交叉反應試驗，通過各種藥物的標準曲線分別得到ic50和交叉反應率。與其他藥物的交叉反應率越小，說明西馬特羅化學發(fā)光檢測試劑盒對西馬特羅的檢測特異性越好。結(jié)果見表2。

表2西馬特羅試劑盒交叉反應率

2)實驗結(jié)果表明：與鹽酸克倫特羅和苯乙醇胺a交叉反應率較高，因此不僅可應用于實際樣品中西馬特羅殘留的篩查檢測，還可以用于鹽酸克倫特羅、苯乙醇胺a的檢測；使用本發(fā)明得到的抗體建立化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對動物尿樣中興奮劑類藥物殘留的快速檢測具有很重要的現(xiàn)實意義。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。