N - （6- 苯基硫烷基-1H-苯并咪唑-2-基）氨基甲酸甲酯對(duì)遍在蛋白 - 蛋白 酶體途徑的損害導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中有效的細(xì)胞毒作用

一種具有潛在治療意義的新型抗增殖劑

來(lái)自印度潘吉布大學(xué)國(guó)家人類(lèi)基因組研究與研究中心，印度昌迪加爾160014

摘要 

近年來(lái)，人們對(duì)蛋白酶體抑制劑作為一類(lèi)新型抗癌藥物產(chǎn)生了很大的興趣。我們報(bào)道，芬苯達(dá) 唑（FZ）（甲基N - （6-苯基硫烷基-1H-苯并咪唑-2-基）氨基甲酸酯）對(duì)癌細(xì)胞系顯示出有效 的生長(zhǎng)抑制活性，但不是正常細(xì)胞。我們?cè)谶@里使用熒光底物顯示，F(xiàn)Z處理導(dǎo)致細(xì)胞中蛋白酶 體活性的抑制。琥珀-LEU-LEU-VAL-酪氨酸-    methylcoumarinamide（MCA），芐氧羰基亮氨酸-亮氨酸-谷氨酸-7-酰氨基-4-  MCA和別用于評(píng)估胰凝乳蛋白酶樣，谷氨噸- 丁氧基羰基-Gln-Ala-Arg-7-酰氨基-4-MCA熒光衍生物分 肽水解和胰蛋白酶樣蛋白酶活性。用編碼pd1EGFP的表?；_(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染并用FZ處理的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞由于其半衰期的增加而在細(xì)胞中顯示綠色熒光 蛋白的積累。發(fā)現(xiàn)通常由遍在蛋白 - 蛋白酶體途徑如細(xì)胞周期蛋白，p53和IκBα降解的許多凋亡 調(diào)節(jié)蛋白在FZ處理的細(xì)胞中積累。此外，F(xiàn)Z誘導(dǎo)了不同的ER應(yīng)激相關(guān)基因，如GRP78， GADD153，ATF3，IRE1α和NOXA在這些細(xì)胞中。因此，用苯達(dá)唑唑處理人NSCLC細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，降低線粒體膜電位和細(xì)胞色素c釋放，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。這是 首次報(bào)道芬多唑?qū)θ朔伟┘?xì)胞系中蛋白酶體功能的抑制和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/活性氧依賴性細(xì)胞凋亡的 抑制作用，這可能代表了一類(lèi)新的抗癌藥物，對(duì)癌細(xì)胞具有選擇性毒性。

關(guān)鍵詞：抗癌藥物，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞生長(zhǎng)，ER應(yīng)激，p53，蛋白酶體，活性氧（ROS）

介紹 

蛋白酶體是主要的蛋白水解復(fù)合物，負(fù)責(zé)真核生物中許多細(xì)胞蛋白的降解。蛋白酶體在細(xì)胞質(zhì) 和細(xì)胞核中都很豐富，它們催化短壽命調(diào)節(jié)蛋白的ATP依賴性蛋白水解以及錯(cuò)誤折疊，受損和 異常蛋白質(zhì)。癌細(xì)胞積累更多氧化或突變/受損的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)被蛋白酶體有效地去除。 因此，它們很可能是更加依賴蛋白酶體的活性與正常細(xì)胞（比較1，2）。有了這個(gè)理由，蛋白 酶體已成為治療人類(lèi)癌癥的目標(biāo)。Bortezomib是美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于治療晚期惡性 血液病患者的第一種蛋白酶體抑制劑。不幸的是，治療的功效僅限于狹窄的治療窗口。硼替佐 米作為單一藥劑在非小細(xì)胞肺癌的活性有限，并且在前面已經(jīng)報(bào)道具有在H460異種移植物沒(méi)有 抗腫瘤活性（3，4）。因此，尋找可以優(yōu)先根除癌細(xì)胞的新型蛋白酶體抑制劑對(duì)于有效治療疾 病具有高度優(yōu)先性。

芬苯達(dá)唑（N-（6-苯基硫烷基-1H-苯并咪唑-2-基）氨基甲酸甲酯）是屬于苯并咪唑類(lèi)的驅(qū)蟲(chóng) 藥，主要用于治療動(dòng)物的pin蟲(chóng)（圖 1A）。臨床上，兩種苯并咪唑衍生物，甲苯咪唑（甲基5-苯甲?；?2-苯并咪唑 -   氨基甲酸酯）和阿苯達(dá)唑（甲基（5-丙硫基）-1H-苯并咪唑-2-基氨基甲酸甲酯）已用于治療人類(lèi)肺泡包蟲(chóng)病，致死性肺蠕蟲(chóng)感染（5）。雖然蟲(chóng)病需要與甲苯咪唑長(zhǎng)期高 劑量治療，嚴(yán)重的副作用到主機(jī)的發(fā)生率是相當(dāng)?shù)偷模?，7）。因此，苯并咪唑作為驅(qū)蟲(chóng)劑具 有良好的記錄，并且在人類(lèi)中具有廣泛的安全性。這些藥物對(duì)寄生蟲(chóng)的選擇性是基于寄生蟲(chóng)攝 取葡萄糖的不可逆阻斷來(lái)解釋的，這導(dǎo)致生殖層中糖原儲(chǔ)存的消耗和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的退化，導(dǎo)致細(xì)胞 死亡（8）。此外，還報(bào)道了這些藥物對(duì)寄生蟲(chóng)的β-微管蛋白的優(yōu)先親和力與宿主相比（9）。 雖然FZ已知抑制聚合和改變寄生細(xì)胞微管功能，其對(duì)哺乳動(dòng)物的微管蛋白的影響還沒(méi)有被看著（10 - 12）。據(jù)報(bào)道，該類(lèi)別的另一種化合物甲苯咪唑在人癌細(xì)胞中具有輕微的微管蛋白解聚 活性。這種優(yōu)先結(jié)合寄生蟲(chóng)微管蛋白的結(jié)構(gòu)解釋是基于哺乳動(dòng)物和寄生蟲(chóng)之間某些關(guān)鍵殘基的 差異，導(dǎo)致苯并咪唑結(jié)合的疏水口袋的“封閉”，從而使其難以接近（13）。在過(guò)去，已經(jīng)出現(xiàn) 了關(guān)于人類(lèi)癌癥（使用苯并咪唑驅(qū)蟲(chóng)藥的幾個(gè)報(bào)告14 - 18），但它們的抑制作用的分子機(jī)制仍 不清楚。

在本研究中，我們報(bào)道用芬苯達(dá)唑（FZ）3治療人肺癌細(xì)胞系誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡，而培養(yǎng)中的 原代正常細(xì)胞仍然廣泛不受影響。FZ可能通過(guò)干擾蛋白酶體功能和誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)發(fā)揮其 細(xì)胞毒性，最終通過(guò)細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。

實(shí)驗(yàn)步驟 

細(xì)胞培養(yǎng)和化學(xué)品 所有細(xì)胞系在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％熱滅活的胎牛血清（FBS）和1x青霉素/鏈霉素抗生素（100單位/ ml青霉素和100μg/ ml 鏈霉素）。根據(jù)各種實(shí)驗(yàn)的需要，用芬苯達(dá)唑，環(huán)己酰亞胺，MG132，NAC，TNFα，Z-VAD- FMK，Tiron或秋水仙堿處理細(xì)胞。

FZ; 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）; 秋水仙堿; MG132; 放線菌酮; JC-1（5,5'，6,6'-四氯-1,1'，3,3'-四乙基 -  苯并咪唑羰基酞菁碘化物）;  Hoechst  33342; 碘化丙錠;N-半胱氨酸; TNFα; Z-VAD-FMK;  蛋白酶體和半胱天冬酶底物; 鈦鐵試劑; 抗β肌動(dòng)蛋白;   抗乙酰Kip1泛素; 抗GFP; anti-p27;  抗Bcl2;  抗小鼠IgG-熒光素異硫氰酸酯（FITC）; 辣根過(guò)氧化物酶（HRP） - 綴合的抗小鼠，抗兔和抗山羊IgG; 并且所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購(gòu)自Sigma。IKK抑制劑 wedelolactone從Calbiochem獲得。抗p53（Bp53-12和DO1），抗p21，抗MDM-2，抗細(xì)胞周期蛋 白B1，抗Bax，抗細(xì)胞色素c抗-IκBα和抗磷酸-JNK購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology，Inc。（Santa Cruz，CA）。

細(xì)胞活力檢測(cè)  將細(xì)胞（5×10    3細(xì)胞/孔）接種到96孔板中，接種后24小時(shí)，用不同劑量的芬苯達(dá)唑處理細(xì)胞。通過(guò)MTT測(cè)定法測(cè)量細(xì)胞活力。對(duì)于細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定，將細(xì)胞以1×10 4細(xì)胞/孔的密 度接種在24孔培養(yǎng)板中，然后用FZ處理。在指定的時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞，并通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法計(jì)數(shù) 活細(xì)胞。所有實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。

Hoechst /（ 染色碘化丙啶  PI  ） 在FZ處理后，將Hoechst  33342和PI以100ng  / ml濃度添加到培養(yǎng)基中15分鐘，然后用預(yù)熱的PBS洗滌細(xì)胞，并在熒光顯微鏡下檢查以檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

FACS分析 用FZ處理指定的時(shí)間間隔后，收獲細(xì)胞，用PBS洗滌，并在4℃下在70％乙醇中固定過(guò)夜。第二天，將細(xì)胞以1000rpm離心5分鐘，小心吸出上清液，將沉淀重懸于含有40μg/ ml PI 和100μg/ ml RNase A的PBS中（19）。在BD FACSArray系統(tǒng)上進(jìn)行FACS分析，并使用FlowJo 軟件分析數(shù)據(jù)。

 TdT分析 將H460細(xì)胞以亞匯合密度接種在35-mm組織培養(yǎng)板中的蓋玻片上。接種后24個(gè)小時(shí)，細(xì)胞不處理或暴露于1μ   米秋水仙堿FZ或130納摩爾24小時(shí)。加尾反應(yīng)物如由Gold所述進(jìn)行（20）。簡(jiǎn)言之，在處理后，用PBS洗滌細(xì)胞并固定在1：3乙酸甲醇中。固定后，用PBS沖洗細(xì)胞，并在潮濕的室中于37℃孵育0.25單位/ mlλ外切核酸酶10分鐘。再次用PBS洗滌細(xì) 胞，并在5μl50nmol生物素-dUTP存在下，在潮濕的室中與20單位/ ml TdT酶一起在37℃溫育1小 時(shí)。然后通過(guò)在室溫下在甲醇中的3％過(guò)氧化氫中溫育15分鐘來(lái)阻斷內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性。最后 使用來(lái)自ABC試劑盒（Vector）和3,3'-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽底物（Sigma）的抗生物素蛋白 - 生物素復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)。

DNA片段化分析  如前所述進(jìn)行DNA片段化測(cè)定（17）。用冷PBS洗滌對(duì)照和FZ處理的細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀在裂解緩沖液（10m M Tris（pH 7.4），10m M EDTA（pH 8.0）和0.5％Triton X-100） 中裂解，并在4℃下孵育10分鐘，然后與200μg一起孵育。 / ml RNase A在37°C下保持1小時(shí)。離 心后，將上清液與200μg/ ml蛋白酶K在50℃下孵育30分鐘。接著，DNA片段用0.5沉淀米 NaCl 和50％的異丙醇，和將樣品裝入2％瓊脂糖TBE凝膠，并用溴化乙錠染色。

免疫熒光 細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)，并用1μ處理米  FZ或130納摩爾秋水仙堿24小時(shí)的。處理后，用PBS洗滌細(xì)胞，并用4％多聚甲醛固定劑固定。再次用PBS洗滌細(xì)胞，并在4℃下與p53抗體一起 溫育過(guò)夜。第二天，在用PBS洗滌數(shù)次后，將細(xì)胞在FITC-綴合的二抗中于37℃溫育1小時(shí)。在 熒光顯微鏡下觀察染色的細(xì)胞。

線粒體膜電位和細(xì)胞色素 釋放的測(cè)量 c將A549細(xì)胞以亞匯合密度接種在35-mm組織培養(yǎng)板中的蓋玻片上。24個(gè)小時(shí)后，將細(xì)胞暴露于指定劑量FZ的24個(gè)小時(shí)或10μ 米 12個(gè)小時(shí)MG132，它們被孵 育5μ以下米中的CO JC-1染料30分鐘2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在用預(yù)熱的PBS洗滌數(shù)次后，使用568nm 濾光器在熒光顯微鏡下定性評(píng)價(jià)線粒體膜電位。

使用免疫熒光染色檢查細(xì)胞色素c的定位。如前所述，用蓋玻片或MG132處理在蓋玻片上生長(zhǎng) 的細(xì)胞。處理后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，用PBS中的4％多聚甲醛固定20分鐘，用PBS中的 0.05％Triton X-100透化5分鐘，充分洗滌，然后用PBS中的山羊血清封閉30分鐘。一抗（抗細(xì)胞 色素c）孵育在4℃下進(jìn)行過(guò)夜。用PBS洗滌幾次后，將細(xì)胞與FITC綴合的二抗在37℃溫育2小 時(shí)，洗滌數(shù)次，并在熒光顯微鏡下觀察。

蛋白酶體和樣蛋Caspase-3 白酶活性的測(cè)定 過(guò)夜培養(yǎng)后，將細(xì)胞與不同劑量的FZ或10μ處理米為指定的時(shí)間周期MG132。然后分離細(xì)胞并加工蛋白酶體活性和半胱天冬酶-3樣蛋白酶活性測(cè)定（21）。熒光底物琥珀酰-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA，Z-Leu-Leu-Glu-7-酰氨基-4-MCA，Boc-Gln- Ala-Arg-7-酰氨基-4-MCA和Ac-    Asp-Glu-Val-Asp-MCA分別用于測(cè)定胰凝乳蛋白酶活性，肽基谷氨酰肽水解活性，胰蛋白酶樣活性和半胱天冬酶-3樣蛋白酶活性。對(duì)于測(cè)定法中，對(duì)照細(xì)胞提取物用各種劑量的FZ培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)或與5μ   米如所示，F(xiàn)Z進(jìn)行不同體外 并測(cè)定蛋白酶活時(shí)間，性。為了評(píng)估FZ對(duì)蛋白酶體蛋白酶活性的直接影響，在蛋白酶活性測(cè)定緩沖液中使用純20S蛋 白酶體（100ng /反應(yīng)）代替細(xì)胞上清液。在線性范圍內(nèi)的特定時(shí)間點(diǎn)（30分鐘）的蛋白酶活性 用于計(jì)算數(shù)據(jù)。使用PerkinElmer Life Sciences Victor X3熒光板讀數(shù)器在380nm激發(fā)和460nm發(fā)射下測(cè)量熒光強(qiáng)度。

RT-PCR和定量PCR 用FZ處理細(xì)胞，并使用硫氰酸胍法分離總RNA（22）。簡(jiǎn)而言之，處理后，將細(xì)胞用PBS洗滌并裂解，并在400微升溶液d（4收集米硫氰酸胍，0.75 米的檸檬酸鈉，10％?

-laurylsarcosine，和0.1 米 β巰基乙醇）。這之后通過(guò)加入40μl的2 米乙酸鈉（pH4.0），400μl水 飽和的苯酚和40μl49：1氯仿/異戊醇。然后將其混合并在冰上溫育15分鐘并在4℃下以9000rpm 離心10分鐘。用等體積的異丙醇沉淀RNA，重懸于焦碳酸二乙酯處理的水中，并使用分光光度 計(jì)定量。最后，使用oligo（dT）18引物逆轉(zhuǎn)錄RNA ，并進(jìn)行RT-PCR分析。對(duì)于定量PCR，使 用來(lái)自Eppendorf的RealMasterMix SYBR ROX試劑盒。根據(jù)Eppendorf Mastercycler Realplex實(shí)時(shí) PCR儀中的制造商說(shuō)明設(shè)置反應(yīng)。

共免疫沉淀和免疫印跡實(shí)驗(yàn) 與pd1EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24個(gè)小時(shí)，將細(xì)胞用不同劑量的FZ或10μ處理米 8小時(shí)MG132。然后用冷PBS洗滌細(xì)胞，并用Nonidet P-40裂解緩沖液（50m M Tris，pH 8.0,150m M NaCl，1％Nonidet P-40，完全蛋白酶抑制劑混合物）在冰上裂解30分鐘。將細(xì)胞裂 解物短暫渦旋并在4℃ 以15,000× g離心10分鐘，并將上清液（總可溶性提取物）用于免疫沉 淀。使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)Bradford的方法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度（23）。對(duì)于每個(gè)免疫 沉淀實(shí)驗(yàn)，將0.2μgNonidetP-40裂解緩沖液中的200μg蛋白質(zhì)與5μl（2.5μg）GFP抗體一起溫育。 在4℃下旋轉(zhuǎn)過(guò)夜孵育后，加入20μl蛋白A / G-瓊脂糖珠，并在4℃繼續(xù)孵育5小時(shí)。用Nonidet P- 40裂解緩沖液洗滌珠子六次。用SDS（1×）樣品緩沖液從珠子上洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，渦旋，煮 沸5分鐘，并通過(guò)免疫印跡分析。通過(guò)10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總細(xì)胞裂解物或免疫 沉淀的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（24）上。將膜依次在封閉緩沖液（TBST 中的5％脫脂乳（50m M Tris，pH 7.5,0.15）中孵育M NaCl，0.05％Tween-20））與一抗，然后與 二抗與辣根過(guò)氧化物酶綴合。用來(lái)自Millipore的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行檢測(cè)。所有一抗均以1：4000稀釋度用于免疫印跡。

組蛋白H1激酶測(cè)定 市售純化的組蛋白H1（Sigma公司）用CDK2從H460全細(xì)胞提取物相當(dāng)于總蛋白的100微克在50μl激酶反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行免疫沉淀（50米孵育米的Tris，pH 7.2的10米米的 MgCl 2，1米米 DTT，5μCi[γ- 32 P] ATP）在25℃下保持10分鐘。通過(guò)SDS-PAGE分析樣品，然 后進(jìn)行放射自顯影。

脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)分析蛋白質(zhì)穩(wěn)定性將細(xì)胞接種到35-mm組織培養(yǎng)板上，第二天，將它們保持未處理或用FZ處理，并在環(huán)己酰亞胺存在下追蹤指定的時(shí)間。然后使用針對(duì)p53，細(xì)胞周期蛋白B1， IκBα或Bax的抗體處理在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的細(xì)胞用于免疫印跡。為了研究GFP穩(wěn)定化，使用 Lipofectamine用pd1EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞。第二天，將細(xì)胞或向左未處理或用5μ處理米 FZ 和在放線菌酮的存在下，所指示的持續(xù)時(shí)間追。在指定的時(shí)間點(diǎn)后在熒光顯微鏡下觀察它們， 或者如上所述使用抗GFP抗體進(jìn)行免疫印跡處理。

電泳遷移率變動(dòng)分析 EMSA用不同劑量的FZ處理H460細(xì)胞4小時(shí)，然后根據(jù)Schreiber制備核提取物（25）。簡(jiǎn)言之，用冷PBS洗滌2×10    6個(gè)細(xì)胞，并懸浮于0.4ml裂解緩沖液（10MHEPES，pH 7.9,10 m M KCl，0.1 m M EDTA，0.1 M EGTA，1 m M DTT，0.5）中。米米苯甲基 磺酰氟，2.0μg/ ml亮抑酶肽，2.0μg/ ml抑肽酶和0.5mg / ml苯甲脒）。使細(xì)胞在冰上溶脹15分 鐘，然后加入12.5μl10％Nonidet P-40。然后將管在渦旋機(jī)上劇烈混合10秒，并將勻漿物離心30 秒。將核沉淀重懸于25μl冰冷的核提取緩沖液（20 m M HEPES，pH 7.9,0.4 M NaCl，1 m M EDTA，1 M EGTA，1 m M DTT，1 m M）中苯甲基磺酰氟，2.0μg/ ml亮抑酶肽，2.0μg/ ml抑肽 酶和0.5mg / ml苯甲脒），將管在冰上溫育30分鐘，間歇混合。然后將其在4℃下離心5分鐘，立 即使用上清液（核提取物）或在-70℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。通過(guò)Bradford（23）的方法測(cè)量蛋白質(zhì)含 量。

通過(guò)將6μg核提取物與16fmol 32 P末端標(biāo)記的45-mer雙鏈NFκB寡核苷酸5'- TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGG-3'（26）在37℃  溫育30分鐘來(lái)進(jìn)行EMSA  。孵育混合物由2-3μg聚（dI-dC）的結(jié)合緩沖液（25m  M    HEPES，pH7.9,0.5m M EDTA，0.5m M DTT，1％Nonidet P-40,5％甘油和50 m M NaCl）。將形成的DNA-蛋 白質(zhì)復(fù)合物與5％天然聚丙烯酰胺凝膠上的游離寡核苷酸分離，然后干燥凝膠。通過(guò)使用過(guò)量的 未標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)來(lái)確定結(jié)合的特異性。

ER應(yīng)激的分泌堿性磷酸酶（SEAP ）測(cè)定 將293T細(xì)胞接種在96孔板中，第二天用pSEAP-con質(zhì)粒（Clontech）轉(zhuǎn)染，其組成型表達(dá)SEAP。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞保持未暴露或在含有1％FBS的 新鮮培養(yǎng)基中暴露于不同濃度的指定藥物。孵育24小時(shí)后，取出10μl條件培養(yǎng)基，并根據(jù)制造 商（Clontech，Palo Alto，CA）描述的方案使用4-MUP底物評(píng)估SEAP活性。簡(jiǎn)言之，將10μl培 養(yǎng)基與15微升5×SEAP測(cè)定緩沖液（0.5混合米為50微升，在96孔板中的總體積的Tris，pH值 9.0，和0.5％BSA）并在65℃溫育30分鐘滅活內(nèi)源性SEAP活性。將板在冰上冷卻2分鐘。然后25μl的1 m M向各孔中加入4-甲基傘形酮磷酸酯底物，并在37℃下孵育2小時(shí)。使用96孔熒光板 讀數(shù)器（PerkinElmer Multilabel reader Victor X3）測(cè)定SEAP的活性，激發(fā)設(shè)定為355nm，發(fā)射 波長(zhǎng)為460nm。一式三份進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

活性氧（ROS）活性 A549細(xì)胞生長(zhǎng)于在35毫米培養(yǎng)皿中的蓋玻片并用5μ處理米 FZ或10μ  米 4小時(shí)MG132。在藥物前2小時(shí)加入NAC（10m M）。為了測(cè)量活性氧物種的，處理后，將細(xì)胞洗滌 并在37℃溫育1μ 中號(hào) DCF-DA在無(wú)血清培養(yǎng)基不含酚紅1個(gè)小時(shí)。洗滌兩次后，用100瓦汞燈照 射樣品，用尼康熒光顯微鏡上的FITC濾光片觀察，觀察DCFDA熒光。對(duì)于定量分析，在Victor 3X熒光計(jì)（PerkinElmer   Life  Sciences）中在485nm激發(fā)后，在530nm處測(cè)量熒光強(qiáng)度。

報(bào)告分析p53和NFκB基因轉(zhuǎn)錄 通過(guò)分別使用pWWP-Luc（27）或NFκB-Luc構(gòu)建體的熒光素酶測(cè)定法測(cè)量FZ對(duì)p53-和NFκB-依賴性報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄的影響。對(duì)于p53轉(zhuǎn)錄活性，在96孔板中用 pWWP-luc和pCMV載體或pCMV-p53（WT）共轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞。根據(jù)制造商的方案使用 Lipofectamine 2000（Invitrogen）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后轉(zhuǎn)染，細(xì)胞未處理或者用1μ處理米 FZ 24 小時(shí)。類(lèi)似地，對(duì)于NFκB報(bào)道分子測(cè)定，用攜帶NFκB結(jié)合位點(diǎn)和pRL-SV40的NFκB-Luc載體 共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。次日，將細(xì)胞用5μ處理米FZ為4小時(shí)，然后是30ng /mlTNFα1小時(shí)，如圖所 示。在兩種情況下，然后制備細(xì)胞提取物，并使用來(lái)自Promega的Dual Luciferase測(cè)定試劑盒按 照制造商的說(shuō)明監(jiān)測(cè)熒光素酶活性。使用96孔熒光板讀數(shù)器（PerkinElmer Life Sciences   Multilabel  reader  Victor  X3）測(cè)定熒光素酶活性。pRL-SV40  Renilla載體在所有情況下用于共轉(zhuǎn)染以使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，并且其以較低濃度轉(zhuǎn)染（比報(bào)告熒光素酶質(zhì)粒低5倍）。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)熒 光素酶活性（螢火蟲(chóng)與Renilla值的比率）。實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)分析 除非另有說(shuō)明，否則所有結(jié)果均表示為平均值±SD。學(xué)生t檢驗(yàn)用于計(jì)算顯著性，接受p<0.05作為顯著性水平。

結(jié)果 

FZ 抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 為了檢查FZ對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，將NSCLC細(xì)胞系（H460和A549）接種到96孔組織培養(yǎng)板上，并在第二天，將細(xì)胞暴露于不同劑量的FZ 48小 時(shí)。通過(guò)MTT測(cè)定確定細(xì)胞活力。暴露于藥物以劑量依賴的方式（降低細(xì)胞的生存力圖1）。該IC  50值計(jì)算為?1.2和1.6μ  米分別為H460和A549細(xì)胞系。如圖所示圖1個(gè) ?，F(xiàn)Z以時(shí)間依賴的方式降低了這些細(xì)胞的生存力。為了確定更長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的細(xì)胞活力，在1ΜM后隔天進(jìn)行 細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定7天H460，A549和正常人支氣管上皮細(xì)胞中的FZ處理（圖1，D-E）。盡管H460和 A549細(xì)胞暴露于FZ時(shí)顯示出降低的活力，但該化合物對(duì)正常人支氣管上皮細(xì)胞幾乎沒(méi)有作用。 然后我們比較了FZ與其他已建立的抗癌藥物的抗增殖能力。與順鉑和紫杉醇相比，時(shí)間依賴性 生長(zhǎng)測(cè)定的結(jié)果清楚地表明FZ是更有效的細(xì)胞毒性劑（圖 1F）。還將FZ在H460和A549細(xì)胞中 的生長(zhǎng)抑制作用與食品和藥物管理局批準(zhǔn)的蛋白酶體抑制劑硼替佐米進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示兩 種化合物的活性相當(dāng)（補(bǔ)充圖1）。有趣的是，當(dāng)我們以劑量依賴的方式用FZ   處理HCT116  p53+ / +和p53  - / -細(xì)胞時(shí)，p53  + /  +細(xì)胞對(duì)FZ的敏感性更高，正如相對(duì)較高的細(xì)胞死亡百分比所揭示的那樣（圖1） G）。我們還評(píng)估了FZ對(duì)源自不同腫瘤類(lèi)型的25種細(xì)胞系的抗增殖作用，所述 腫瘤類(lèi)型例如肺，前列腺，乳腺，子宮頸和結(jié)腸，其列于設(shè)計(jì)用于藥物篩選的NCI-60組中。這 些細(xì)胞系中的大多數(shù)具有大于1ΜM的 IC 50值。然而，在至少7種細(xì)胞系中，F(xiàn)Z在1ΜM濃度下誘 導(dǎo)約50％的生長(zhǎng)抑制（補(bǔ)充表1）。盡管FZ在NSCLC細(xì)胞中引起生長(zhǎng)抑制和凋亡，但正常的短 期原代培養(yǎng)物或永生化的正常細(xì)胞系相對(duì)不受其作用的影響（補(bǔ)充圖2）。發(fā)現(xiàn)FZ 的IC 50值在 這些正常細(xì)胞中比在癌細(xì)胞系中高幾倍?？傊?，這些結(jié)果表明FZ在癌細(xì)胞的情況下充當(dāng)細(xì)胞增 殖的抑制劑，但對(duì)正常細(xì)胞相對(duì)無(wú)毒。

NSCLC細(xì)胞用FZ的溫育導(dǎo)致核縮合和凋亡的核形態(tài)的碎片特性（圖2，和b）。用Hoechst    33342和PI雙重染色細(xì)胞以檢查它們的核形態(tài)和質(zhì)膜完整性。與對(duì)照未處理細(xì)胞相比，48小時(shí)FZ處理的細(xì)胞具有顯著數(shù)量的凋亡細(xì)胞核。其中許多呈現(xiàn)橙紅色，是晚期凋亡的特征（圖 2A，cd）。用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)一步標(biāo)記細(xì)胞核以驗(yàn)證細(xì)胞死亡的細(xì)胞凋亡性質(zhì)。

TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目顯著觀察后48小時(shí)治療FZ（圖2），然后將其定量（圖2乙?）。從處理過(guò)的細(xì)胞中提取的DNA表現(xiàn)出明顯的梯狀圖案，這是凋亡細(xì)胞死亡的特征（圖 2D）。

當(dāng)我們進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，結(jié)果表明，F(xiàn)Z處理導(dǎo)致細(xì)胞在G中積累2 / M細(xì)胞周期，隨后在分G的百分比的顯著增加的階段1凋亡人口，指示DNA降解的（圖2   E）。這可能是由于FZ誘導(dǎo)的 G 2  / M檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)分子的穩(wěn)定化，這有助于增強(qiáng)細(xì)胞毒性。細(xì)胞周期延遲G 2  /   M可能是由于CDK2磷酸化的加速和延長(zhǎng)以及細(xì)胞周期蛋白B1，p53和p21的穩(wěn)定，這些都與G 2 / M檢查點(diǎn)的 控制有關(guān)（28）。CDK2激酶的磷酸化狀態(tài)控制Cdc2-細(xì)胞周期蛋白B1復(fù)合物的活性，其負(fù)責(zé)有 絲分裂的發(fā)生。因此，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)一步檢查參與G  2   / M轉(zhuǎn)換的蛋白質(zhì)水平。

FZ處理對(duì)p53蛋白穩(wěn)定性的影響 因?yàn)槲覀冊(cè)缙诘慕Y(jié)果表明p53可能在使細(xì)胞對(duì)FZ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感中起作用，我們?cè)贔Z處理后對(duì)p53進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)。圖3（）示出的p53水平24和顯著增加在兩個(gè)H460和A549細(xì)胞FZ處理后48個(gè)小時(shí)與對(duì)照未處理的細(xì)胞相比，免疫熒光在H460細(xì)胞中p53清楚地表明在處理的細(xì)胞的細(xì)胞核的蛋白質(zhì)的增加的積累（圖3（II））。為了確定FZ誘導(dǎo)的p53活化的動(dòng)力學(xué)，我們研究了與1μ處理后的依賴于時(shí)間的響應(yīng)米FZ，如圖圖3（iii）。在處理后2小時(shí)觀察到p53誘導(dǎo)，并在24小時(shí)達(dá)到平臺(tái)期。接下來(lái)我們繼續(xù)檢查這種蛋白質(zhì)水平的增加是否是轉(zhuǎn)錄上調(diào)的結(jié)果。為此，在FZ處理24或48小時(shí)后，從對(duì)照 和處理的細(xì)胞中分離總RNA。我們使用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR來(lái)分析p53基因表達(dá)。結(jié)果表明，F(xiàn)Z處理 細(xì)胞中p53蛋白的積累并未伴隨其mRNA水平的相應(yīng)增加（圖  3B（i）），這通過(guò)實(shí)時(shí)PCR證實(shí)（圖 3B（ii））。由于未發(fā)現(xiàn)p53在轉(zhuǎn)錄水平上被FZ上調(diào)，這些結(jié)果促使我們進(jìn)一步研究導(dǎo)致其在細(xì)胞中積累的事件。我們推測(cè)這可能是由于抑制降解途徑，并且蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白水 解步驟的阻斷可能是這種穩(wěn)定性的原因。有了這個(gè)基本原理，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，有趣的是，在使 用p53抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡的較長(zhǎng)時(shí)間曝光后，我們可以清楚地檢測(cè)到FZ處理后野生型（WT） p53泛素化形式的顯著增加，如對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)（的泛素化形式更高分子量條帶圖3    ?）。

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中間部分圖片太多難以編輯，對(duì)試驗(yàn)感興趣的可以上網(wǎng)搜索或直接聯(lián)系我們查看原文，下面直接上結(jié)論

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討論 

FZ屬于一類(lèi)廣譜驅(qū)蟲(chóng)藥，苯并咪唑類(lèi)，具有高治療指數(shù)。苯并咪唑作為有效驅(qū)蟲(chóng)劑成功的關(guān)鍵 因素可歸因于它們對(duì)蠕蟲(chóng)的選擇性毒性和對(duì)正常人細(xì)胞的高度安全性。由于其結(jié)構(gòu)的改進(jìn)或通 過(guò)在代謝和哺乳動(dòng)物和目標(biāo)寄生蟲(chóng)（之間的差異解毒途徑由苯并咪唑寄生微管蛋白的選擇性靶 向：該先前已兩種不同現(xiàn)象的基礎(chǔ)上，說(shuō)明10 - 12，38）。早些時(shí)候，一些屬于這一類(lèi)的化合 物已被證明可作為有效的抗腫瘤藥物，盡管分子機(jī)制仍然難以捉摸。在本研究中，我們顯示芬 苯達(dá)唑可作為生長(zhǎng)抑制劑，并在人肺癌細(xì)胞系中引起凋亡細(xì)胞死亡。

適當(dāng)?shù)陌邢虻鞍姿鈱?duì)細(xì)胞功能和體內(nèi)平衡至關(guān)重要。在真核細(xì)胞中，泛素蛋白酶體途徑是蛋 白質(zhì)降解的中心非溶酶體途徑（39）。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)被泛素 - 蛋白酶體系統(tǒng)選擇性地降解， 這反過(guò)來(lái)又使細(xì)胞的存在變得至關(guān)重要。泛素化底物和降解的動(dòng)態(tài)平衡在細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞 存活（一個(gè)重要的角色39，40）。因此，不言而喻，該途徑的功能障礙將促進(jìn)細(xì)胞死亡。可以 預(yù)見(jiàn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白酶體功能的藥理學(xué)抑制誘導(dǎo)雙重凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，這取決于特定的細(xì)胞 環(huán)境，并且各種蛋白酶體抑制劑已被推向治療應(yīng)用，硼替佐米（Velcade）是第一個(gè)臨床批準(zhǔn)的 小分子蛋白酶體抑制劑（41）。然而，據(jù)報(bào)道硼替佐米在非小細(xì)胞肺癌來(lái)源的異種移植小鼠模 型中沒(méi)有抗腫瘤活性（3）。硼替佐米后，幾種第二代蛋白酶體靶向藥物如NPI- 0052（salinosporamide A），MLN9708，CEP18770（第一階段），argyrin A，和卡非佐米（第 三階段）已進(jìn)入臨床試驗(yàn)（1，41 - 45）。我們的結(jié)果表明，F(xiàn)Z作為蛋白酶體功能的抑制劑，并 通過(guò)激活線粒體途徑導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

首先，我們已經(jīng)證明暴露于FZ會(huì)抑制細(xì)胞蛋白酶體功能的劑量和時(shí)間依賴性，并導(dǎo)致各種細(xì)胞 蛋白質(zhì)（包括p53）的泛素化衍生物的積累，而這反過(guò)來(lái)又通過(guò)線粒體途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。通過(guò) 抑制不穩(wěn)定的增強(qiáng)的綠色熒光蛋白，蛋白酶體的模型底物以及蛋白酶體如IκBα，p53和細(xì)胞周 期蛋白B1的各種其他細(xì)胞底物的降解進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。最后，我們已經(jīng)證明FZ處理導(dǎo)致線粒體膜電位的變化，細(xì)胞色素c釋放從線粒體進(jìn)入胞質(zhì)溶膠，并激活下游半胱天冬酶，然后進(jìn)行PARP裂解。然而，廣譜半胱酶抑制劑Z-VAD-FMK基本上沒(méi)有從FZ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中拯救細(xì)胞，這表明存在替代的，不依賴半胱天冬酶的機(jī)制，其有助于FZ的細(xì)胞殺傷作用。

我們的結(jié)果顯示，響應(yīng)FZ處理，細(xì)胞首先經(jīng)歷G 2 / M停滯然后凋亡。先前已報(bào)道p53活化是由 蛋白酶體抑制劑引起的細(xì)胞死亡的關(guān)鍵事件（46）。因?yàn)镕Z處理導(dǎo)致p53的顯著誘導(dǎo)和其靶基 因的相應(yīng)上調(diào)，這可能有助于通過(guò)線粒體途徑經(jīng)歷細(xì)胞死亡的細(xì)胞。因此，F(xiàn)Z誘導(dǎo)的蛋白酶體 功能障礙可間接導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素c釋放。除了p53和其靶基因，蛋白酶體抑制也可調(diào)節(jié)細(xì)胞 凋亡途徑中以及在細(xì)胞生長(zhǎng)和存活途徑（牽連其他蛋白質(zhì)的表達(dá)47，48）。各種細(xì)胞蛋白降解 的這種改變將導(dǎo)致它們的表達(dá)水平的變化，這反過(guò)來(lái)可能影響細(xì)胞存活并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此 外，我們還報(bào)道了FZ處理后NFκB轉(zhuǎn)錄活性的抑制。這可能歸因于IκBα的穩(wěn)定性和半衰期的增 加，已知IκBα抑制NFκB細(xì)胞存活途徑。我們提供證據(jù)表明FZ誘導(dǎo)的蛋白酶體功能障礙可阻止 IκBα的降解，從而阻斷NFκB的核轉(zhuǎn)位和反式激活。在這種情況下，可以指出的是，NFκB途 徑，其可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激中發(fā)揮關(guān)鍵作用，已知通過(guò)蛋白酶體抑制劑（被禁用49， 50）。FZ誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生可能與ROS相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)。我們的數(shù)據(jù)顯示FZ處理后的PIG3誘 導(dǎo)。PIG3是氧化還原酶的p53誘導(dǎo)基因同源物，據(jù)報(bào)道它與p53誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的升高有關(guān)（51）。蛋白酶體抑制可能會(huì)累積線粒體損傷并在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激（52）。反過(guò)來(lái)，氧化應(yīng)激可以 通過(guò)產(chǎn)生過(guò)量水平的受損蛋白質(zhì)，引起未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)或通過(guò)降低ATP產(chǎn)生水平來(lái)影響蛋 白酶體功能。蛋白酶體抑制劑之前已經(jīng)報(bào)道引發(fā)ER應(yīng)激反應(yīng)（53，54）。某些化合物通過(guò)ER 應(yīng)力-ROS誘導(dǎo)選擇性地殺死癌細(xì)胞，因?yàn)榘┘?xì)胞被預(yù)期對(duì)ROS應(yīng)力響應(yīng)途徑強(qiáng)烈依賴與正常細(xì) 胞（比較55 - 58）。總之，我們的結(jié)果表明FZ通過(guò)蛋白酶體功能的損傷和誘導(dǎo)的未折疊蛋白反 應(yīng)誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。

泛素 - 蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的組成部分。越來(lái)越多的人認(rèn)識(shí)到這種途徑對(duì)正常細(xì)胞 功能和疾病的根本重要性已經(jīng)促使人們深入研究選擇性阻斷這些途徑功能的小分子抑制劑。因此，我們提出FZ作為靶向泛素 -   蛋白酶體途徑并有效殺死癌細(xì)胞的新型候選藥物。

FZ的作為抗腫瘤劑的功效，正在研究。