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冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)和相關(guān)蛋白研究進(jìn)展

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冠狀病毒是屬于尼多病毒目(Nidovirales)單股 正鏈 RNA 病毒,感染多種哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)物種。 常引起消化道和呼吸道疾病,有時(shí)可導(dǎo)致臨床疾 病爆發(fā)流行,例如在2003年爆發(fā)嚴(yán)重急性呼吸道 綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)。為更好地預(yù)防高致 病性冠狀病毒出現(xiàn),需要加深對(duì)冠狀病毒生物學(xué) 特性解和研究。

1 冠狀病毒分類(lèi)

冠狀病毒家族根據(jù)形態(tài)、基因組結(jié)構(gòu)和基因 表達(dá)情況分為兩個(gè)亞科,即冠狀病毒亞科(Corona? virinae)和凸隆病毒亞科(Torovirinae)。在遺傳和 血清學(xué)特性基礎(chǔ)上,Coronavirinae亞科又被劃分成三個(gè)新屬,即α、β γ 冠狀病毒屬[2]。最近,又命 名一個(gè)新的 δ 冠狀病毒屬[3]。每個(gè)屬再根據(jù) pp1ab 復(fù)制酶結(jié)構(gòu)域不同劃分成不同物種。α 冠狀病毒1 群包括豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、貓的腸道冠 狀病毒(FECV)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)和犬 冠狀病毒(CCoV)。α冠狀病毒2群主要包括鼬腸道 冠狀病毒(FRECV)、鼬全身冠狀病毒(FRSCV)、 水貂冠狀病毒(MCOV)、人類(lèi)冠狀病毒229EHCoV- 229E)、人類(lèi)冠狀病毒 NL63HCoV-NL63)、豬流 毒(PEDV)和 HKU2 RH-BatCoV HKU2)。β 冠狀病毒是分型比較復(fù)雜 一個(gè)屬,現(xiàn)在分為4個(gè)亞群(A、B、CD)。A 包括人類(lèi)冠狀病毒OC43HCoV-OC43)、牛冠狀病BCoV)、豬凝血腦脊髓炎病毒(PHEV)、人冠狀 病毒 HKU1HCoV-HKU1)、鼠肝炎病毒(MHV)和 馬冠狀病毒(ECoV);B 群包括人 SARS 冠狀病毒 SARS- CoV)和 SARS HKU3 SARSr-Rh-BatCoV HKU3);C群有扁顱蝠屬冠狀 病毒HKU4Ty-BatCoV-HKU4)和伏翼屬冠狀病毒 HKU5Pi-BatCoV-HKU5);D群有果蝠屬冠狀病毒 HKU9Ro-BatCoV-HKU9)。γ 冠狀病毒屬包括雞 傳染性支氣管炎病毒(IBV)、火雞冠狀病毒(Tu? coV)、白鯨冠狀病毒(BWCoV SW1)。δ冠狀病毒屬 包括白頭翁冠狀病毒 HKU11BuCoV HKU11)、畫(huà) 眉冠狀病毒 HKU12ThCoV HKU12)和文鳥(niǎo)冠狀病 HKU13MunCoV HKU13)。

 2 冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

冠狀病毒是最大單股正鏈 RNA 病毒(25-31 kb),其基因組基本模式是包含至少6個(gè)開(kāi)放閱讀 框(Open reading frame, ORF),5'和3'非編碼區(qū)(Un? translated region, UTR)位于兩側(cè)[4]。各種冠狀病毒 依據(jù)基因組結(jié)構(gòu)的不同分成不同群,α冠狀病毒具 有相似基因組結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(Transcription regulating sequence, TRS)均為 CUAAAC,ORF 1ab 編碼 16 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural protein, NSP), 具有兩個(gè)木瓜蛋白酶位點(diǎn),其中α-A 群病毒在 3' 端具有非結(jié)構(gòu)蛋白NSP7NSP7a/7b,而α-B群病 PEDV則缺少這個(gè)基因。α-B群病毒是 α 屬病毒 中除α-A群病毒之外冠狀病毒,其各個(gè)成員之間并 不具備相似基因組結(jié)構(gòu)。研究證實(shí),FCoV-Ⅰ是經(jīng) 典貓冠狀病毒,CCoV-Ⅱa 是經(jīng)典犬冠狀病毒, FCoV-Ⅱ型則一部分基因與CCoV-Ⅱa同源,包括 pp1ab 3'端一部分至 E 基因。CCoV-Ⅰ S 基因與 FCoV- Ⅰ , 個(gè) 獨(dú) ORF3 CCoV-ⅡbS基因5'端與TGEV進(jìn)行重組[5],并且 α冠狀病毒可以感染不同種蝙蝠,表現(xiàn)出進(jìn)化的多 樣性。全基因組序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明,蝙蝠可 能是所有冠狀病毒起源的宿主。

β 屬冠狀病毒結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜,β-A群具有兩個(gè) 木瓜蛋白酶位點(diǎn),都具有特殊基因:血凝素酯酶 Hemagglutinin-esterase, HE)和NSP3HCoV-HKU1 只有HE)。而B群中其他病毒則只有1個(gè)木瓜蛋白 酶位點(diǎn),并且在 M N 基因之間都含有幾個(gè)小開(kāi) 放閱讀框(Open reading frames, ORFs),只有果蝠屬冠狀病毒 HKU9 N 基因后有兩個(gè)下游基因 NSP7a/7b[8]。Beta-A 群冠狀病毒 TRS CUAAAC Beta冠狀病毒屬其他病毒為ACGAAC[9]。2012年在 荷蘭分離出一株新結(jié)構(gòu)類(lèi)型HCoV-EMC/2012,與 其親緣關(guān)系最近的是蝙蝠冠狀病毒 HKU4BtCoV HKU4)和蝙蝠冠狀病毒 HKU5BtCoV HKU5),是 6個(gè)感染人冠狀病毒,也是第一個(gè)β-C群病毒。

γ群冠狀病毒,γ-A 亞群中 IBV TucoV 具有 相似的基因組結(jié)構(gòu),γ-A 5'-UTR-POL-S-3A- 3B-E-M-5A-5B-N-3' UTR,TRSCUUAACAA 缺少NSP7。近年也分離到一些特殊結(jié)構(gòu)基因型的 IBV[11],最新研究表明火雞冠狀病毒可能完全是 Gamma冠狀病毒(IBV)重組產(chǎn)生[12]。γ-B群白鯨γ 狀病毒 SW1 具有冠狀病毒最大基因組(31.86 kb), MN基因之間含有8個(gè)ORFs序列。

 δ群冠狀病毒是已知最小基因組冠狀病毒 25.421-26.674 kb),包括鳥(niǎo)類(lèi)3個(gè)親緣關(guān)系較近的 病毒[3],基因組結(jié)構(gòu)與其他冠狀病毒類(lèi)似,特征性 基因順序是:5'-UTR-ORF1ab-S-E-M-N-3'UTR。 這些冠狀病毒毒株是SW1遠(yuǎn)親,并發(fā)現(xiàn)其與亞洲 豹貓冠狀病毒(ALCv)有較近親緣關(guān)系[14]。

3 冠狀病毒基因組功能研究進(jìn)展

3.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列

5' UTR 與病毒復(fù)制有關(guān),不同株冠狀病毒 5' UTR 序列相對(duì)保守,具有真核細(xì)胞中啟動(dòng)子活 性。三個(gè)主要冠狀病毒組5' UTR140 bp包含3個(gè) 主要頸環(huán)結(jié)構(gòu),SL1,SL2SL4。SL1熱力學(xué)穩(wěn)定 性很低,SARS- CoV 5'UTR 啟動(dòng)域包含莖環(huán) Stem-loop domainsSL1 SL2,SL1 對(duì) MHV 的復(fù) 制是非常重要的,同時(shí)并不是很保守,存在一定的 不匹配和凸起[15]。SL2在所有冠狀病毒是保守,并 有一個(gè)序列特征一致U形轉(zhuǎn)彎式構(gòu)象,是冠狀病毒 次基因組RNA形成關(guān)鍵[16]。在一些冠狀病毒SL3構(gòu) 成其核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(L-TRS)。所有冠狀病毒均 具有長(zhǎng)發(fā)夾形SL4,SL4包含兩個(gè)堿基配對(duì)區(qū)SL4A SL4B, SL4 SL1 SL2 TRS,并參與引導(dǎo)亞基因組 RNA 合成,一系列試 驗(yàn)表明單獨(dú)缺失SL4ASL4B對(duì)病毒可行,而刪除 全部 SL4 對(duì)病毒的復(fù)制是致命的[17]。SL5 存在于α β 冠狀病毒,反映冠狀病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系, 點(diǎn)是存在一個(gè)大的順序插入能力與保守5'-UUYC?GU-3'循環(huán)序列并形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

3'UTR結(jié)構(gòu)已被廣泛研究,在 βMHVBCoV 都具有相似突起莖環(huán)(Bulged stem-loop, BSL)、假 結(jié)(Pseudoknot, PK[19]和一個(gè)與毒力相關(guān)高變區(qū) Hypervariable region, HVR), MHV HVR 對(duì) RNA合成不是必要,但是影響其發(fā)病。

3.2 復(fù)制酶基因

ORF1 位于病毒基因組 5'端編碼病毒復(fù)制酶, 包括ORF1aORF1b分別編碼兩個(gè)多聚蛋白(Poly? protein),即pp1a486 ku)和pp1b790 ku[20],這兩 個(gè)蛋白裂解產(chǎn)生 15 16 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1- NSP16),ORF1a 編碼 NSP1-NSP11,ORF1b 編碼 NSP12-16[21]。

NSP1主要功能是誘導(dǎo)宿主mRNA 降解,轉(zhuǎn)錄 抑制,細(xì)胞周期阻滯,SARS-CoVNSP1是宿主基 因表達(dá)的強(qiáng)效抑制劑,具有獨(dú)特作用方式:它綁 定到 40S 核糖體使其翻譯功能失活,并誘導(dǎo)宿主 mRNA降解。NSP1誘導(dǎo)RNA模板裂解表現(xiàn)在RNA 裂解位點(diǎn)特定堿基序列并沒(méi)有明顯偏好。SARSCoVmRNA,其結(jié)構(gòu)類(lèi)似宿主mRNA,這使其不 容易受到NSP1介導(dǎo)的RNA裂解作用,同時(shí)抑制宿 主先天免疫功能,包括在被感染細(xì)胞I型干擾素表 達(dá) , SARS- CoV NSP1 SARS-CoV致病過(guò)程中起著至關(guān)重要作用。

NSP2不在病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮作用,而是參 與改變宿主細(xì)胞環(huán)境??赡軈⑴c在SARS冠狀病毒 感染宿主細(xì)胞中與抑制素蛋白1PHB1)和PHB2 互作用,并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)中斷,發(fā)揮拮抗干擾 素信號(hào)作用,并且在病毒粒子中也能檢測(cè)到NSP 2, 3, 8的存在。

Coronavirus Torovirus NSP3 序列根據(jù)功能構(gòu) 造和系統(tǒng)發(fā)育三個(gè)方面進(jìn)行比對(duì)后繪制詳細(xì)功能 結(jié)構(gòu)域,有16個(gè)組成結(jié)構(gòu)。SARS冠狀病毒木瓜 樣蛋白酶(PLP),從事和拮抗IFN誘導(dǎo)和NF-κB 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PLP阻止這些影響重要信號(hào)蛋白在各 通路激活,IRF3 NF-κB 途徑。PLP 泛素樣結(jié)構(gòu) 域?qū)τ谵卓棺饔檬潜匾?/span>α βNSP3具有ADP- 核糖結(jié)合活性(gamma群不具活性),抑制α/β干擾 素,RNA結(jié)合和去泛素活性。

NSP4被證明是一個(gè)重要蛋白質(zhì),NSP4、NSP6 具有 DMV 形成功能,并在冠狀病毒復(fù)制階段早 期發(fā)揮作用[31]。包含四個(gè)預(yù)測(cè)跨膜區(qū)域(TM 1、23、4),對(duì)于病毒復(fù)制復(fù)合物在細(xì)胞膜上形成和功 能維持是必不可少,在冠狀病毒感染細(xì)胞中其定 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并誘導(dǎo)形成雙膜囊泡(DMV)。

 NSP5 是主要蛋白酶 3CL-蛋白酶(3CLpro MPRO),相對(duì)比較保守,可以切割復(fù)制酶polyprot? eins 1A 1ABpp1a pp1ab)使之裂解為 12 個(gè)蛋 白質(zhì)(NSP5-NSP16)。NSP6是一種6次跨膜的膜 蛋白,可以激活細(xì)胞自噬,誘導(dǎo)ER穿孔。 NSP7- NSP10蛋白共定位于復(fù)制復(fù)合物,這些 蛋白質(zhì)每個(gè)確切功能是未知,可能參與病毒 RNA 合成,NSP8具有引物酶活性,在NSP12 RdRp進(jìn) RNA 復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)揮作用。NSP9NSP10 具有部分復(fù)制酶活性,NSP9形成二聚體,對(duì)于病 毒大量快速?gòu)?fù)制必不可少。NSP11 具體功能未知, NSP13 發(fā)揮解旋酶作用,NSP14 具有 3'~5'核 糖核酸外切活性, NSP14介導(dǎo)校對(duì)機(jī)制闡明對(duì)于理 RNA 病毒演變有重要意義。NSP15 主要功能是 內(nèi)切酶活性,NSP16 RNA帽子結(jié)構(gòu)(2' O-methy? transferase)。

3.3 結(jié)構(gòu)蛋白

冠狀病毒其余病毒基因組合成包裝病毒 RNA 核衣殼蛋白(N)、纖突糖蛋白(S)、跨膜蛋白(M 和小膜蛋白(E)。β-B群冠狀病毒還表達(dá)一個(gè)額外 結(jié)構(gòu)蛋白,血凝素酯酶(HE)。 3.3.1 S蛋白

冠狀病毒S蛋白參與病毒與細(xì)胞受體結(jié)合、介 導(dǎo)病毒與宿主膜融合。同時(shí),S蛋白主要負(fù)責(zé)誘導(dǎo) 宿主免疫反應(yīng)和病毒中和抗體。S蛋白還決定病毒 組織嗜性。有研究證明冠狀病毒 S1亞基都有一個(gè) 共同進(jìn)化起源。此外,宿主細(xì)胞受體血管緊張素 轉(zhuǎn)換酶(ACE-2)和氨基肽酶NAPN),也被確定與 S 蛋白結(jié)合發(fā)揮受體功能,S 蛋白 N-末端至少有 3個(gè)區(qū)域是受體結(jié)合域。冠狀病毒S蛋白除與主要 受體結(jié)合外,還存在著替代受體。并在病毒裝配 和出芽中發(fā)揮作用[39]

3.3.2 M蛋白 

冠狀病毒M蛋白具有相同基本結(jié)構(gòu)特征。蛋白 質(zhì)含有 3 個(gè)跨膜域(TM)和 1 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(CD), 兩側(cè)短氨基末端糖基化域和羧基末端尾巴,位于 病毒粒子內(nèi)部和外部,是病毒包膜重要組成成分 和病毒釋放關(guān)鍵蛋白。除 TGEV FIPV M 蛋白可 以出現(xiàn)在細(xì)胞膜外,其他冠狀病毒 M 蛋白(包括SARS-CoV均只表達(dá)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,參與 病毒裝配和出芽。其保守結(jié)構(gòu)域?qū)τ诓《狙b配是 非常重要,主要通過(guò)M-M、M-SM-N蛋白相互 作用,參與病毒復(fù)制裝配和出芽。SARS-CoVM C端細(xì)胞質(zhì)部分負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)結(jié)合控制。并可以抑 I型干擾素生產(chǎn)。M蛋白Y195對(duì)于SARS-CoVSM相互作用在感染性病毒粒子裝配時(shí)是必須。

3.3.3 N蛋白 

冠狀病毒核衣殼蛋白(N蛋白)有一個(gè)結(jié)構(gòu)性作 用,并參與RNA合成。核衣殼蛋白(N)在冠狀病毒 RNA 合成中發(fā)揮重要作用,但其具體作用還不清 楚。多個(gè)調(diào)查顯示,MHV 感染早期階段或SARSCoV復(fù)制酶組件內(nèi)共存N蛋白,在TGEVSARSCoV 均發(fā)揮分子伴侶作用,N 蛋白與 NSP3 結(jié)合在 感染早期階段有復(fù)制酶作用,并可以在病毒裝配過(guò) 程中穩(wěn)定M蛋白復(fù)合物。

3.3.4 E蛋白 

冠狀病毒 E 蛋白,包含一個(gè)單一疏水結(jié)構(gòu)域 HD),并含有一個(gè)跨膜α -螺旋結(jié)構(gòu)域(ETM),是 病毒粒子包膜組成成分。E 蛋白具有離子通道活 性,在發(fā)揮離子通道作用時(shí),是形成五聚體高級(jí) 結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用,冠狀病毒EM控制著病毒粒子 組裝,研究證實(shí)E蛋白缺失突變株喪失致病力。

3.3.5 輔助蛋白 

不同種冠狀病毒具有一套獨(dú)特的病毒輔助蛋 白,即3A、3B6、7A7B、8A、8B9B。這些蛋白在病毒感染過(guò)程中表達(dá),但是對(duì)于病毒復(fù)制并非必須。 3A 蛋白是 SARS-CoV 最大輔助蛋白,也是病 毒粒子組成成分,其重組蛋白可以形成一個(gè)四聚 體蛋白離子通道,這可能會(huì)促進(jìn)病毒釋放功能。 并可以促進(jìn)高爾基體膜重排和細(xì)胞死亡,可導(dǎo)致 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而誘導(dǎo)1型干擾素下調(diào)。 IBV 3a3b蛋白對(duì)于病毒復(fù)制為必須[44]。 3B蛋白是通過(guò)激活ERKJNK通路介導(dǎo),可以 抑制干擾素,上調(diào)AP-1轉(zhuǎn)錄活性,并具有RUNX1b 轉(zhuǎn)錄活性,SARS-CoV3B蛋白可以誘導(dǎo)G0/G1期阻 滯和細(xì)胞凋亡,抑制誘導(dǎo)型干擾素產(chǎn)生[45] 。 輔助蛋白6可以阻斷I型干擾素信號(hào),表明其 抑制先天免疫效應(yīng),并阻礙蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核, 抑制共轉(zhuǎn)染表達(dá)結(jié)構(gòu)和在泡狀結(jié)構(gòu)亞細(xì)胞器定 位,其N-端區(qū)域可能具有誘導(dǎo)膜重排和病毒復(fù)制兩個(gè)功能。 7A 蛋白是一種 I 型跨膜蛋白,7A 通過(guò)半胱天 冬酶依賴(lài)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,可以作為RNA抑制 劑,抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成,激活p38絲裂原活化蛋 白激酶(MAPK),抑制細(xì)胞周期進(jìn)程在 G0/G1期, 7A蛋白與人類(lèi)Ap4A水解酶相互作用,可能參與調(diào) 節(jié)細(xì)胞增殖、DNA 復(fù)制、RNA 加工、細(xì)胞凋亡和 DNA修復(fù)[47] SARS-CoV9B蛋白擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞核,經(jīng)過(guò)主動(dòng) CRM1介導(dǎo)核質(zhì)出口和核保留并觸發(fā)細(xì)胞凋亡。

4 展 望

迄今為止,SARS-CoV三個(gè)重要蛋白組研究顯 示,前兩個(gè)蛋白質(zhì)組,即多聚蛋白(pp1a/pp1ab)和 結(jié)構(gòu)蛋白,所有冠狀病毒都有同源相似之處。詳 細(xì)分析顯示其重要差異,但這些差異是否有助于 對(duì)于冠狀病毒解認(rèn)識(shí)仍有待進(jìn)一步研究。而第三 組病毒蛋白,即位于SN蛋白之間各群獨(dú)特輔助 蛋白基因序列,在冠狀病毒之間并沒(méi)有相似性和 規(guī)律,對(duì)這些獨(dú)特 ORF 特性解可以深入理解冠狀 病毒與宿主相互作用及其與臨床癥狀和病理變化 關(guān)系,更加深入地揭示其病理發(fā)生機(jī)制。

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