通過(guò)將機(jī)器學(xué)習(xí)和生信分析應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證隊(duì)列，作者在這里展示了非腫瘤COVID-19患者可以在入院時(shí)被分類為不同的免疫表型。這些免疫類型預(yù)測(cè)隨后的臨床進(jìn)展和結(jié)果。這種免疫類型可以指導(dǎo)實(shí)用生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)，也可以指導(dǎo)更個(gè)性化的治療。

1. 通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)在急性COVID-19疾病中識(shí)別出不同的免疫類型

在這項(xiàng)研究中，作者選擇在臨床嚴(yán)重程度方面采取無(wú)偏見(jiàn)的方法，首先定義非腫瘤COVID-19患者的免疫類型，然后檢查這些是否與臨床嚴(yán)重程度和進(jìn)展有關(guān)。在入院時(shí)，作者通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)和生信分析測(cè)量了非腫瘤COVID-19患者（鹿特丹隊(duì)列）血清中具有促炎、抗炎或抗病毒活性的特定細(xì)胞因子模塊。作者將這些血清細(xì)胞因子與宿主適應(yīng)性抗體反應(yīng)相結(jié)合，并使用無(wú)監(jiān)督分層聚類應(yīng)用機(jī)器學(xué)習(xí)來(lái)識(shí)別捕獲對(duì)SARS-CoV-2感染的先天和適應(yīng)性反應(yīng)的免疫表型。重要的是，作者沒(méi)有使用臨床嚴(yán)重程度作為聚類變量。使用這種方法，作者在急性感染的非腫瘤COVID-19患者中確定了三種不同的免疫類型（BRI、EXI、LAI）（圖 1A）。為了驗(yàn)證這些免疫類型，作者將相同的機(jī)器學(xué)習(xí)方法應(yīng)用于巴塞羅那隊(duì)列進(jìn)行生信分析（圖 1B）。主成分生信分析（PCA）顯示巴塞羅那隊(duì)列數(shù)據(jù)的測(cè)量與鹿特丹數(shù)據(jù)非常匹配（圖 1C）。來(lái)自巴塞羅那隊(duì)列的測(cè)量值的獨(dú)立無(wú)監(jiān)督層次聚類始終顯示將患者分類為三種不同的免疫類型 BRI、EXI 和 LAI，它們表現(xiàn)出與鹿特丹隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)的相似的細(xì)胞因子和抗體特征（圖 1A、B ）。

圖1 急性COVID-19患者的三種不同的免疫類型

作者進(jìn)一步測(cè)試了免疫型的穩(wěn)健性，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行交叉驗(yàn)證生信分析，從預(yù)測(cè)角度估計(jì)分層準(zhǔn)確性。作者使用從5%、10%、15%、20% 和 25% 增加測(cè)試百分比，并使用150次迭代。后者的中位數(shù)精度分別為0.83、0.80、0.80、0.80、0.81，這表明模型預(yù)測(cè)略微取決于訓(xùn)練集的大小。這三種免疫類型的特征在于不同的血清細(xì)胞因子譜和抗SARS-CoV-2抗體反應(yīng)（圖 2）。由于該CE認(rèn)證的ELISA系統(tǒng)允許檢測(cè)NC特異性IgM、Ig和IgA同種型，因此測(cè)量了抗SARS-CoV-核衣殼蛋白（NC）抗體，這可以揭示同種型特異性差異。與健康對(duì)照相比，所有三種免疫型都具有增加的促炎細(xì)胞因子（圖 2A），顯示出它們之間的進(jìn)一步顯著差異。免疫型BRI的特征是低促炎、抗病毒和抗炎細(xì)胞因子和正常的TGFβ1水平（圖 2A）。BRI表現(xiàn)出強(qiáng)大的IgM、IgG和IgA抗SARS-CoV-2 NC抗體（圖 1A、B和2B）。相比之下，EXI具有更多的促炎特征、低IFNα和正常TGFβ1（圖 2A）。免疫型EXI還與IgM、IgG和IgA抗SARS-CoV-2抗體相關(guān)（圖 1A、B和2B）。免疫型LAI表現(xiàn)出與前兩種不同的特征，其特征是存在強(qiáng)烈的IFNα 反應(yīng)、減少的TGFβ1（圖 2A）和非常低的抗體免疫（圖 1A、B和2B）。與其他兩種免疫類型相比，EXI中的促炎細(xì)胞因子顯著更高（圖 2A）。

圖2 COVID-19免疫類型具有不同的細(xì)胞因子和抗SARS-CoV-2抗體水平

正如預(yù)期的那樣，作者發(fā)現(xiàn)抗SARS-CoV-2 IgM、IgG和IgA抗體彼此密切相關(guān)（圖 2C）。與抗體最強(qiáng)的細(xì)胞因子相關(guān)性與IFNα呈負(fù)相關(guān)（圖 2C）。這可能表明抗體減少了病毒載量，從而減少了IFNα，或者相反，高IFNα水平延遲或抑制了抗體的產(chǎn)生。促炎細(xì)胞因子相互關(guān)聯(lián)（圖2C）?？共《炯?xì)胞因子IFNα和IFNγ相互關(guān)聯(lián)，而IFNα與TGFβ1負(fù)相關(guān)（圖 2C）。因此，三種免疫類型的特征可以由不同的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)驅(qū)動(dòng)。

2. COVID-19免疫類型可預(yù)測(cè)臨床嚴(yán)重程度進(jìn)展

作者接下來(lái)研究了這些不同的免疫類型是否與臨床參數(shù)相關(guān)。如前所述，臨床嚴(yán)重程度沒(méi)有用作無(wú)監(jiān)督層次聚類的變量。在研究開(kāi)始時(shí)，BRI和LAI在WHO臨床嚴(yán)重程度評(píng)分方面沒(méi)有差異，而EXI顯著更高（圖 3A）。因此，在研究開(kāi)始時(shí)，免疫類型不是由疾病嚴(yán)重程度決定的。為了評(píng)估住院期間的臨床嚴(yán)重程度進(jìn)展，作者檢查了患者在入院后30天內(nèi)表現(xiàn)出的最高/最差臨床評(píng)分。住院期間，EXI和LAI的特征是臨床惡化和更高的WHO臨床嚴(yán)重程度峰值評(píng)分（圖 3A）。相比之下，進(jìn)入后BRI有所改善，臨床評(píng)分下降（圖 3A）。反映住院期間更嚴(yán)重的疾病評(píng)分，所有死亡率都發(fā)生在EXI和LAI患者中，而沒(méi)有患者在BRI中死亡（圖 1A、B和3B）。此外，BRI免疫型患者與EXI或LAI免疫型組患者的住院總天數(shù)（圖 3C）和ICU總天數(shù)（圖 3D）也存在顯著差異。這些免疫類型之間嚴(yán)重程度的差異不能歸因于年齡，因?yàn)檫@些差異沒(méi)有顯著差異（圖3E）。盡管BRI和EXI組之間的性別分布顯著不同（圖 3F），但BRI和LAI以及EXI和LAI之間沒(méi)有檢測(cè)到顯著差異，表明性別不是三種免疫類型的預(yù)測(cè)決定因素。為了評(píng)估和強(qiáng)調(diào)不同分子標(biāo)記和其他變量的重要性，使用Wilcoxon秩和/Mann-Whitney U檢驗(yàn)在三種免疫類型中直接比較這些變量。作者還使用單變量和多變量方法對(duì)每個(gè)生物標(biāo)志物應(yīng)用邏輯回歸模型，其中性別、年齡和DFSO作為多因素生信分析的附加變量?？傮w而言，未檢測(cè)到非參數(shù)和參數(shù)測(cè)試之間的顯著差異，并進(jìn)一步證實(shí)性別、年齡和DFSO沒(méi)有定義免疫型的參數(shù)。因此，盡管免疫型在研究開(kāi)始時(shí)疾病相對(duì)較輕，但EXI和LAI表型捕獲了住院后臨床惡化、死亡率更高、住院時(shí)間更長(zhǎng)和ICU天數(shù)增加的患者，而BRI確定了臨床上會(huì)改善的患者。

圖3 免疫類型可預(yù)測(cè)急性 COVID-19 的臨床改善或惡化

3. COVID-19免疫類型不是由疾病持續(xù)時(shí)間定義的

盡管三種免疫型在進(jìn)入時(shí)從癥狀出現(xiàn)的天數(shù)（DFSO）上有所不同，但LAI的疾病持續(xù)時(shí)間最短，但DFSO的差異并不能解釋這些表型（圖 4A-C）。細(xì)胞因子和抗體水平與 DFSO 沒(méi)有顯著相關(guān)性，表明免疫類型不是由疾病持續(xù)時(shí)間決定的（圖 4B，C）。更重要的是，即使在10天的DFSO仍然具有高水平的IFNα而抗體反應(yīng)保持沉默后，LAI的三種免疫類型之間的抗體和細(xì)胞因子的動(dòng)力學(xué)也不同（圖 4B，C）。另一方面，在DFSO為5天的EXI患者中，IL-6和TNFα的含量很高（圖 4B）。對(duì)于個(gè)體免疫類型，抗SARS-CoV-2抗體反應(yīng)在DFSO方面具有不同的軌跡。在BRI和EXI患者中，抗體提早出現(xiàn)并持續(xù)存在（圖 4C）。與LAI相比，BRI和EXI中抗SARS-CoV-2抗體陽(yáng)性患者的頻率增加，與癥狀出現(xiàn)后的時(shí)間無(wú)關(guān)（圖 4D）。因此，感染持續(xù)時(shí)間不能解釋LAI的高IFNα或低抗體。DFSO也未能與住院天數(shù)和ICU天數(shù)相關(guān)。這支持了這樣一種觀點(diǎn)，即免疫類型反映了個(gè)體患者的反應(yīng)性質(zhì)和免疫發(fā)展速度，而不是與感染持續(xù)時(shí)間的嚴(yán)格線性時(shí)間關(guān)系。

圖4 病程不決定免疫類型

4. 免疫類型的臨床實(shí)驗(yàn)室特征不同

三種免疫類型在血漿炎癥標(biāo)志物和血細(xì)胞數(shù)量方面存在顯著差異。EXI中炎癥C反應(yīng)蛋白（CRP）、鐵蛋白、d-二聚體、乳酸脫氫酶（LDH）標(biāo)志物的血漿水平均顯著升高（圖5A）。引人注目的是，與BRI相比，LAI中的這些并沒(méi)有增加。EXI 中白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞最高，而EXI和LAI中淋巴細(xì)胞水平趨于降低，但不顯著（圖 5B）。然而，LAI患者的血小板顯著降低（圖 5B）。鼻咽拭子中的病毒載量在免疫類型之間沒(méi)有顯著差異，但在 LAI 中趨于更高（圖 5C），而在LAI患者中，病毒載量與IFNα水平無(wú)關(guān)（圖 5D）。最后，作者發(fā)現(xiàn)病毒載量與DFSO 之間沒(méi)有相關(guān)性。

圖5 免疫類型的臨床實(shí)驗(yàn)室特征不同

5. 免疫型的深度表型揭示了COVID-19患者血液中明顯的細(xì)胞變化

為了深入了解所描述的三種免疫類型背后的潛在機(jī)制，作者使用了40色光譜流式細(xì)胞術(shù)并確定了與這些免疫類型相關(guān)的免疫細(xì)胞亞群變化（圖 6）。盡管非腫瘤COVID-19患者作為一個(gè)整體與健康個(gè)體明顯不同，但在研究開(kāi)始時(shí)比較免疫類型發(fā)現(xiàn)它們之間的差異非常小。與健康個(gè)體相比，非腫瘤COVID-19患者的漿母細(xì)胞增加（圖 6B-D）。促炎中間單核細(xì)胞1和210以及IgD-CD27-B 細(xì)胞在患者的血液中均增加（圖 6C）。相比之下，患者血液中的非經(jīng)典單核細(xì)胞減少（圖 6C），這些抗炎細(xì)胞的丟失可能進(jìn)一步促進(jìn)免疫激活。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和常規(guī)DC在患者中也都減少了（圖6B-D）。當(dāng)將三種免疫型相互比較時(shí)，幾乎沒(méi)有差異（圖6E，F(xiàn)）。與LAI相比，EXI中只有中間單核細(xì)胞2強(qiáng)烈增加（圖 6F，G）?？傮w而言，盡管非腫瘤COVID-19 患者和健康對(duì)照之間存在很大差異，但免疫類型之間的差異是微妙的，這突出了免疫類型中外周血細(xì)胞和全身血漿細(xì)胞因子之間的脫節(jié)。

圖6 高維流式細(xì)胞術(shù)揭示了免疫類型之間明顯的免疫亞群差異