眾所周知線粒體是細(xì)胞的發(fā)電廠。它以呼吸鏈作為發(fā)電機(jī)組，以糖酵解等分解代謝反應(yīng)釋放的高能物質(zhì)NADH和FADH2為原料，通過氧化磷酸化反應(yīng)生成通用能量物質(zhì)ATP。線粒體疾病是一大類因線粒體功能受損導(dǎo)致多器官退行性病變的統(tǒng)稱，人群發(fā)病率為1/5000。呼吸鏈功能下降是線粒體疾病的普遍特征。截止到2020年，線粒體疾病已知有331個(gè)致病基因，其中導(dǎo)致呼吸鏈損傷的突變基因占了75%以上【1】。

對(duì)單個(gè)細(xì)胞而言，呼吸鏈損傷導(dǎo)致事關(guān)生死的多個(gè)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，其中之一是 NADH/NAD 比值升高。通常情況下，胞質(zhì)內(nèi)NADH攜帶的電子會(huì)通過malate-aspartate shuttle和glycerol-3-phosphate shuttle傳遞給呼吸鏈消耗，再生NAD ，從而保證胞質(zhì)內(nèi)分解代謝反應(yīng)的持續(xù)運(yùn)作。呼吸鏈停工后，胞質(zhì)內(nèi)NADH持續(xù)積累，導(dǎo)致NADH/NAD 比值升高，從而抑制NAD 依賴的諸多代謝反應(yīng)，糖酵解即是其中之一（圖1）。作為呼吸鏈停工后ATP的唯一來源，糖酵解告急嚴(yán)重威脅細(xì)胞生存。因此，尋找NAD 再生通路可能為緩解呼吸鏈損傷帶來的代謝危機(jī)和治療線粒體疾病帶來曙光。

圖1. 呼吸鏈損傷導(dǎo)致NADH積累和代謝紊亂

2021年7月15日，北京生命科學(xué)研究所/清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院蔣輝實(shí)驗(yàn)室在Cell Metabolism在線發(fā)表題為Glycerol-3-phosphate biosynthesis regenerates cytosolic NAD to alleviate mitochondrial disease的文章，揭示了一條進(jìn)化上保守的NAD 再生通路Glycerol-3-phosphate (Gro3P) biosynthesis，并為復(fù)合物I缺失導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病提供了治療靶點(diǎn)。

Gro3P biosynthesis是進(jìn)化上保守的NAD 再生通路

作者對(duì)人基因組中NAD 依賴的代謝酶及其反應(yīng)做了系統(tǒng)分析挑選出8條潛在的NAD 再生通路。由于以酵母和線蟲為代表的低等生物可以承受相當(dāng)嚴(yán)重的呼吸鏈損毀（酵母甚至可以在無氧（無呼吸）環(huán)境中生長），提示它們能夠有效再生NAD ，作者進(jìn)一步考察了候選通路在酵母中的保守性，最后挑選出了3條進(jìn)化上保守的通路。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，作者發(fā)現(xiàn)糖酵解的一條旁側(cè)通路Gro3P（glycerol-3-phosphate，3-磷酸甘油）biosynthesis是真正重要的NAD 再生通路（圖2）。

Gro3P biosynthesis在酵母、線蟲、人類腫瘤細(xì)胞和小鼠肝臟中都存在且在呼吸鏈被抑制后大幅增強(qiáng)。呼吸鏈缺失的酵母和線蟲能夠正常增值和存活，在二者里敲除Gro3P 合成酶導(dǎo)致合成致死。敲除Gro3P 合成酶的腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件和體內(nèi)腫瘤移植實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出對(duì)缺氧和復(fù)合物I抑制劑metformin的高度敏感。與之類似，小鼠肝臟也利用Gro3P biosynthesis來拮抗呼吸鏈抑制；在肝臟特異敲除Gro3P合成酶后，小鼠在呼吸鏈抑制劑處理時(shí)表現(xiàn)出更嚴(yán)重的代謝紊亂（圖2）。

增強(qiáng)Gro3P biosynthesis拮抗復(fù)合物I 缺失并治療復(fù)合物I缺失導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病

腫瘤細(xì)胞雖然有Gro3P biosynthesis能力，但無法像酵母一樣在呼吸鏈缺失后還能正常生長，一般表現(xiàn)為極緩慢生長。作者意外發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中增強(qiáng)Gro3P biosynthesis會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在復(fù)合物I缺失或抑制時(shí)，可以像正常細(xì)胞一樣生長（圖3）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)Gro3P biosynthesis激活了Gro3P shuttle，可以繞過復(fù)合物I把胞質(zhì)NADH的電子傳遞給呼吸鏈。該意料之外的結(jié)果為后續(xù)復(fù)合物I相關(guān)疾病研究打開了一扇大門。

圖3.增強(qiáng)Gro3P shuttle可以挽救呼吸鏈復(fù)合物I缺失細(xì)胞的代謝與生長。在呼吸鏈復(fù)合物I缺失（NDUFS2-KO）細(xì)胞中，過表達(dá)cGPD (GPD1/1L)可以增強(qiáng)Gro3P synthesis，激活GPD2介導(dǎo)的Gro3P shuttle, 把電子繞過復(fù)合物I傳遞給呼吸鏈，從而恢復(fù)代謝和細(xì)胞生長。GPD1-K204A和GPD1L-K206A為失活型突變體。

線粒體復(fù)合物I缺失是影響人數(shù)最多的線粒體疾病，通常導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元死亡，由于控制運(yùn)動(dòng)的核團(tuán)受損，病人和小鼠模型常死于呼吸衰竭【2】。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Gro3P biosynthesis通路在人和小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)都很弱?；诖耍髡?strong>用AAV在Ndufs4^-/-小鼠（復(fù)合物I缺失的Leigh syndrome模型）神經(jīng)系統(tǒng)中過表達(dá)Gro3P合成酶GPD1，發(fā)現(xiàn)可以激活Gro3P shuttle，顯著抑制神經(jīng)炎癥，挽救小鼠運(yùn)動(dòng)缺陷和延長小鼠壽命（圖4）。

值得一提的是，呼吸鏈復(fù)合物I亞基由核DNA和mtDNA共同編碼，mtDNA編碼的復(fù)合物I亞基ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6都會(huì)發(fā)生突變導(dǎo)致Leber’s Heredity Optic Neuropathy (成人視神經(jīng)退行性疾病) ，MELAS, Leigh syndrome, MERRF(兒童神經(jīng)退行性疾病)等惡性疾病。由于目前無法用回補(bǔ)或修復(fù)損壞基因的方法來治療mtDNA突變，用小分子或AAV基因治療手段增強(qiáng)Gro3P biosynthesis為mtDNA突變引起的復(fù)合物I缺失疾病提供了潛在的治療方案。該研究相關(guān)發(fā)明已申請(qǐng)國際專利。

該研究的第一作者是蔣輝實(shí)驗(yàn)室劉珊珊博士，其他作者包括蔣輝實(shí)驗(yàn)室傅松，曹鈺，李蘭蘭博士，楊俊；王國棟（劉清華實(shí)驗(yàn)室）和劉清華博士；李雪梅博士（董夢秋實(shí)驗(yàn)室）和董夢秋博士；代謝中心馬燕博士，曹楊，單雅兵等。蔣輝博士為本文通訊作者。

1. Thompson, K., Collier, J.J., Glasgow, R.I.C., Robertson, F.M., Pyle, A., Blakely, E.L., Alston, C.L., Olahova, M., McFarland, R., and Taylor, R.W. (2020). Recent advances in understanding the molecular genetic basis of mitochondrial disease. Journal of inherited metabolic disease 43, 36-50.

2. Quintana, A., Zanella, S., Koch, H., Kruse, S.E., Lee, D., Ramirez, J.M., and Palmiter, R.D. (2012). Fatal breathing dysfunction in a mouse model of Leigh syndrome. The Journal of clinical investigation 122, 2359-2368.