【原】BD Rhapsody讓你輕松高效進(jìn)行腦科學(xué)單細(xì)胞研究！

優(yōu)寧維 2022-01-27

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大腦是人體最重要的器官，也可能是宇宙間最復(fù)雜的物體——結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能復(fù)雜，比目前規(guī)模最大的超級(jí)計(jì)算機(jī)還要復(fù)雜無(wú)數(shù)倍。僅占據(jù)我們?nèi)梭w小部分的大腦，包含著千億個(gè)神經(jīng)元，相互之間還存在著令人難以捉摸的復(fù)雜聯(lián)系，多年來(lái)科學(xué)家們被她的神秘所吸引。面對(duì)如此“精密”的器官，如何高效對(duì)其進(jìn)行多方位研究，一直是眾多科學(xué)家們頭疼的問(wèn)題：
01大眾化的方法如免疫標(biāo)記（immunostaining）或是流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, FACS）等雖奏效，但可同時(shí)研究的參數(shù)卻十分有限
02當(dāng)在沒(méi)有特定分子標(biāo)記的先驗(yàn)知識(shí)時(shí)，關(guān)鍵的干細(xì)胞以及神經(jīng)祖細(xì)胞群會(huì)很難分離
03早期的單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)（scRNA-seq）極易受到低細(xì)胞數(shù)量的限制
我們來(lái)看看頂刊中眾多研究者們?nèi)绾芜\(yùn)用前沿的技術(shù)方法和好的工具平臺(tái)解決這些問(wèn)題，高效進(jìn)行腦科學(xué)單細(xì)胞研究！

一、人類(lèi)大腦皮層的發(fā)育涉及到神經(jīng)元的遷移整合。來(lái)自美國(guó)斯坦福大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)利用一種3D分化方法，在培養(yǎng)皿中成功誘導(dǎo)神經(jīng)球（neural spheroid）定向發(fā)育成大腦皮層球狀體（human cortical spheroids, hCS）以及大腦皮層下球狀體（human subpallium spheroids, hSS），并將兩者在體外進(jìn)行組裝，以促使細(xì)胞遷移和人腦皮質(zhì)回路的發(fā)育

為全面表征hCS和hSS單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息，研究人員利用了BD Rhapsody單細(xì)胞多組學(xué)分析系統(tǒng)，在其分化的第105天將11,838個(gè)hCS或hSS結(jié)合并酶解成單個(gè)細(xì)胞，分批進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。其中，單細(xì)胞的捕獲方式是通過(guò)有限稀釋法將單細(xì)胞懸浮液隨機(jī)分布在＞200,000個(gè)微孔中得以實(shí)現(xiàn)的。后續(xù)，研究人員根據(jù)BD Rhapsody single-cell whole-transcriptome amplification workflow制備全轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，并利用BD Rhapsody analysis pipeline處理分析數(shù)據(jù)。通過(guò)t分布隨機(jī)鄰域嵌入（tSNE）方法，從hCS或hSS中分離出的細(xì)胞聚類(lèi)顯示了兩種條件下的分離狀況。
組裝后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)電生理測(cè)試表明，GABA能和谷氨酸能神經(jīng)元能夠成功形成電路并相互發(fā)送信號(hào)。這一成果無(wú)疑為研究神經(jīng)發(fā)育和疾病以及神經(jīng)環(huán)路等提供了一個(gè)有用的模型。

二、為了驗(yàn)證體外誘導(dǎo)分化特異器官上的可靠性，美國(guó)斯坦福大學(xué)的研究人員于體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)12種人類(lèi)多能干細(xì)胞系（hiPSC lines）分化形成hCSs，并利用BD Rhapsody對(duì)分化產(chǎn)物進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，以證實(shí)該過(guò)程的可重復(fù)性

在分化的第105天，研究人員將三個(gè)平行分化為hCS-FF（Feeder-Free condition，無(wú)滋養(yǎng)層細(xì)胞條件）的hiPSC lines酶解為單個(gè)細(xì)胞并進(jìn)行捕獲。再通過(guò)對(duì)BD Rhapsody磁珠進(jìn)行二次采樣，從約67%的捕獲細(xì)胞中制備全轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，然后進(jìn)行后續(xù)的cDNA合成等操作，并利用BD Rhapsody analysis pipeline處理測(cè)序數(shù)據(jù)，確定細(xì)胞標(biāo)記和分子指數(shù)。最后，使用BD Data View 對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜進(jìn)行分析，并將當(dāng)前數(shù)據(jù)結(jié)果與之前于同一平臺(tái)上獲取的hCS-MEF（Mouse Embryonic Fibroblasts，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）和hSS單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行比較（n=24,237）。
tSNE聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，來(lái)自hCS和hSS的細(xì)胞群聚類(lèi)揭示了背側(cè)和腹側(cè)分化狀態(tài)的不同。該研究表明，體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方案在不同實(shí)驗(yàn)條件、不同干細(xì)胞系之間具有良好的重復(fù)性，而細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的差異主要來(lái)源于分化時(shí)期，并非細(xì)胞種系或?qū)嶒?yàn)條件。

三、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（FGF21）是一種肝臟源激素，可向下丘腦腹內(nèi)側(cè)（ventromedial hypothalamus，VMH）的谷氨酸能神經(jīng)元發(fā)出信號(hào)，以抑制碳水化合物的攝入

在此項(xiàng)試驗(yàn)中，來(lái)自愛(ài)荷華大學(xué)醫(yī)學(xué)院和丹麥哥本哈根大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)充分利用了BD Rhapsody單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)，以合理評(píng)估哪些細(xì)胞能夠在下丘腦中表達(dá)FGF21的輔助受體KIb（β-klotho）：首先通過(guò)BD 流式平臺(tái)對(duì)小鼠下丘腦中的目標(biāo)單細(xì)胞進(jìn)行篩選，然后將篩選出的細(xì)胞加載到BD Rhapsody上捕獲單個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行cDNA的合成。后續(xù)，使用兩個(gè)定制引物panel生成cDNA文庫(kù)，該panel由BD設(shè)計(jì)，分別包含低豐度表達(dá)基因和高豐度表達(dá)基因。通過(guò)該方法以及BD Resolve analysis pipeline，研究人員對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行了有效的細(xì)胞排序、質(zhì)量過(guò)濾和測(cè)序數(shù)據(jù)注釋?zhuān)罱K獲得了1,904個(gè)分類(lèi)后推定的Klb細(xì)胞。隨后，運(yùn)用tSNE分析和無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)，確定了12個(gè)神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞類(lèi)型的聚類(lèi)。
通過(guò)這一途徑，研究人員得以精確識(shí)別下丘腦中的FGF21靶細(xì)胞，并揭示了激活谷氨酸能神經(jīng)元的FGF21信號(hào)是介導(dǎo)FGF21誘導(dǎo)的糖抑制和甜味偏好的必要和充分條件。

四、天津醫(yī)科大學(xué)、天津市神經(jīng)病學(xué)研究所劉強(qiáng)教授課題組在此前的文獻(xiàn)中報(bào)道了腦出血（Perihematomal edema，PHE）后血腫周?chē)X水腫（intracerebral hemorrhage，ICH）形成的免疫機(jī)制

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，研究者使用BD Rhapsody捕獲單細(xì)胞，并通過(guò)BD Rhapsody WTA Amplification Kit構(gòu)建單細(xì)胞RNA-seq文庫(kù)，采用BD Rhapsody數(shù)據(jù)分析流程處理測(cè)序數(shù)據(jù)，并利用BD Data View對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜進(jìn)行分析，繪制了血液對(duì)照組（sham blood）、腦水腫出血組（ICH blood）和腦水腫腦樣本（ICH brain sample）中12,443個(gè)、8,751個(gè)和4,270個(gè)自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞的基因表達(dá)譜。其中，NK細(xì)胞從naive C57BL/6小鼠（BD Bioscience）的脾細(xì)胞中分離，經(jīng)純化后在FACS Aria III系統(tǒng)上進(jìn)行兩輪細(xì)胞分選。
單細(xì)胞測(cè)序和免疫學(xué)研究表明，NK細(xì)胞是ICH早期階段的主要免疫細(xì)胞亞群，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜的無(wú)偏聚類(lèi)顯示，腦出血后，兩個(gè)主要的NK細(xì)胞亞群分別具有高的細(xì)胞毒性或強(qiáng)烈的趨化因子產(chǎn)生特征，與周?chē)腘K細(xì)胞相區(qū)別。

前沿技術(shù)推薦
這么多頂刊中，研究者們都在使用的單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)平臺(tái)BD Rhapsody，輕松解決以上腦科學(xué)研究中存在的技術(shù)難題：
1BD Rhapsody單細(xì)胞多組學(xué)分析系統(tǒng)是目前唯一可在同一次實(shí)驗(yàn)中獲得轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、免疫組庫(kù)（VDJ）和多樣本分析結(jié)果的單細(xì)胞平臺(tái)，豐富的多維度參數(shù)讓腦科學(xué)的研究更加深入和全面
2BD Rhapsody特有的DNA分子標(biāo)簽包含多達(dá)88萬(wàn)種細(xì)胞標(biāo)簽及約750萬(wàn)種基因標(biāo)簽，能在單細(xì)胞水平上，對(duì)每個(gè)細(xì)胞、每個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行精準(zhǔn)標(biāo)記，高效分離干細(xì)胞及神經(jīng)祖細(xì)胞群
3相較于早期的低通量單細(xì)胞RNA測(cè)序方法，BD Rhapsody 具有更高的細(xì)胞通量和靈敏度，基于經(jīng)典的微孔板原理，單次實(shí)驗(yàn)可分離100-40000個(gè)細(xì)胞，同時(shí)，該平臺(tái)對(duì)細(xì)胞懸液濃度的要求可低至40個(gè)/ul，對(duì)于腦科學(xué)研究中的一些微量樣本如腦脊液等也同樣適用。