撰文：huacishu

IF=41.583

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亮點(diǎn)：

1、作者繪制了人類腺瘤和鋸齒狀息肉的單細(xì)胞分辨率圖譜；

2、作者證明鋸齒狀息肉源于化生，而不是干細(xì)胞擴(kuò)張；

3、作者證明鋸齒狀息肉的細(xì)胞毒性免疫獨(dú)立于超突變；

4、作者證明不同的免疫微環(huán)境可以跟蹤腫瘤細(xì)胞分化狀態(tài)。

范德堡大學(xué)Ken S. Lau博士課題組在國(guó)際知名期刊Cell在線發(fā)表題為“Differential pre-malignant programs and microenvironment chart distinct paths to malignancy in human colorectal polyps”的論文。結(jié)直腸癌（CRC）起源于結(jié)直腸息肉，其細(xì)胞起源、分子異質(zhì)性和免疫原性可能在高分辨率分析時(shí)揭示診斷和治療見(jiàn)解。文章展示了兩種最常見(jiàn)的人類結(jié)直腸息肉的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和成像圖譜，即常規(guī)腺瘤和鋸齒狀息肉。對(duì)62名參與者的128個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行綜合分析后發(fā)現(xiàn)，腺瘤起源于WNT驅(qū)動(dòng)的干細(xì)胞擴(kuò)增，而鋸齒狀息肉則來(lái)源于通過(guò)胃化生分化的細(xì)胞?；嚓P(guān)損傷與超突變前的細(xì)胞毒性免疫微環(huán)境相耦合，部分原因是與腫瘤細(xì)胞分化狀態(tài)相關(guān)的抗原呈遞差異。作者的的多組學(xué)圖譜提供了大腸息肉惡性進(jìn)展及其微環(huán)境的見(jiàn)解，作為精確監(jiān)測(cè)和預(yù)防結(jié)直腸癌的方法。

采用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）、多重免疫熒光（MxIF）和多重免疫組織化學(xué)（MxIHC）進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)（DIS）集包括65個(gè)分析標(biāo)本，包括30個(gè)腫瘤。驗(yàn)證（VAL）集包括63個(gè)分析樣本，包括32個(gè)腫瘤（圖1A）?？偟膩?lái)說(shuō)，在62個(gè)腫瘤上生成了128個(gè)獨(dú)立的scRNA序列數(shù)據(jù)集。標(biāo)本來(lái)自不同性別、種族和年齡組。此外，分別對(duì)66個(gè)和281個(gè)息肉進(jìn)行了大量RNA序列和靶向基因測(cè)序。在組織學(xué)上將息肉分為兩個(gè)亞型：由管狀A(yù)Ds（TAs）和管狀類ADs（TVAs）組成的ADs，或由增生性息肉（HPs）和SSL組成的鋸齒狀息肉（SER）（圖1B）。通過(guò)進(jìn)行全外顯子組測(cè)序（WES）和體細(xì)胞突變調(diào)用（圖1C），對(duì)ADs和SER的突變譜進(jìn)行了表征。由于息肉體積小，單細(xì)胞分析優(yōu)先考慮新鮮組織，使用福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）材料進(jìn)行WES。在85%的TA和兩種TVA中檢測(cè)到APC突變。只有一個(gè)（8%）TA有KRAS突變，而兩個(gè)TVAs都有。除了一個(gè)SSL（89%）外，所有SSL都有致癌BRAF^V600E突變；三個(gè)GCHPs中沒(méi)有一個(gè)攜帶BRAF突變，但有兩個(gè)（67%）MVHPs攜帶BRAF突變，這與MVHPs是進(jìn)化中的SSL一致。在SSLs中未檢測(cè)到APC和KRAS突變，并且所有ADs均未檢測(cè)到BRAF突變。令人驚訝的是，沒(méi)有一個(gè)SSL表現(xiàn)出超突變表型，而一部分TA/TVA表現(xiàn)出超突變表型。由于啟動(dòng)子甲基化，MSI-H CRC中的MLH1表達(dá)通常丟失，而SSLs中的MLH1蛋白和基因表達(dá)與ADs相當(dāng)，兩者均高于MSI-H CRC的平均水平。在任何息肉中均未檢測(cè)到錯(cuò)配修復(fù)基因的雙等位基因缺失，進(jìn)一步證明這些SSL尚未獲得超突變表型。

由于轉(zhuǎn)錄因子（TF）定義的調(diào)控子活動(dòng)被認(rèn)為是細(xì)胞身份的決定因素，因此使用SIVENT（單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷和聚類），這是一種基于調(diào)控子的提取工具，用于調(diào)整息肉特異性效應(yīng)。將DIS數(shù)據(jù)集中的上皮細(xì)胞聚集，以正?；顧z數(shù)據(jù)集為參考標(biāo)志，顯示了七個(gè)正常、規(guī)范的上皮細(xì)胞群（圖2A和2B）。息肉標(biāo)本也含有大量與其組織病理學(xué)一致的正常細(xì)胞（圖1B、2B）。然而，兩個(gè)細(xì)胞群體在息肉樣本中占絕大多數(shù)，這是由比例聚類代表性的逐樣本細(xì)分確定的（圖2B和2C）。一個(gè)群體富含TA和TVA，以下稱為ASCs（AD特異性細(xì)胞）。第二個(gè)腫瘤群體富含SSL和HPs，以下稱為SSC（鋸齒狀特異性細(xì)胞）。重要的是，這些結(jié)果以及下面的其他結(jié)果在DIS和VAL數(shù)據(jù)集中是一致的（圖2A-2C），證明了其精確性和再現(xiàn)性。ASC類似于結(jié)腸干細(xì)胞和祖細(xì)胞，表達(dá)WNT通路激活的基因（LGR5、OLFM4、ASCL2、AXIN2、RNF43和EPHB2）（圖2A），并且具有比來(lái)自相同個(gè)體的正常干細(xì)胞更大的干細(xì)胞特征（圖2D）。由于ASC與正常干細(xì)胞相似，使用細(xì)胞追蹤來(lái)推斷其干細(xì)胞潛能。正常干細(xì)胞具有較高的細(xì)胞追蹤分?jǐn)?shù)，并轉(zhuǎn)化為分?jǐn)?shù)較低的分化細(xì)胞（圖2E），形成了干細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和分化細(xì)胞之間相對(duì)一致的分?jǐn)?shù)分布。相比之下，ASCs的細(xì)胞追蹤分析得出的分布偏向具有高預(yù)測(cè)干細(xì)胞潛能的細(xì)胞（圖2E）。利用TF靶點(diǎn)相似性創(chuàng)建了一個(gè)共同的TF調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，描述了基因作為程序和途徑的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)。一些協(xié)調(diào)的調(diào)控子簇，稱之為超級(jí)調(diào)控子，在ASC和SSC中的比例過(guò)高，包括以MYC、ASCL2、TCF7和TEAD1活性為標(biāo)志的WNT-和Hippo-驅(qū)動(dòng)的超級(jí)調(diào)控子（圖2F），與這些程序在腸干細(xì)胞再生和更新中的作用一致。對(duì)于支持損傷誘導(dǎo)化生過(guò)程作用的SSC，觀察到一個(gè)超級(jí)調(diào)節(jié)子，指示白細(xì)胞介素信號(hào)和微生物群相互作用（圖2G）。在另外58個(gè)ADs（36個(gè)TA，22個(gè)TVA）和8個(gè)SSL上，用批量RNA序列驗(yàn)證了分類息肉亞型的基因特征。這些結(jié)果證實(shí)了作者的發(fā)現(xiàn)：在ADs中，WNT激活了干細(xì)胞擴(kuò)增程序，在SSLs中，WNT激活了胃化生程序。

由于SSC可能來(lái)源于分化細(xì)胞的化生，作者假設(shè)SER來(lái)源于腫瘤發(fā)生的“自上而下”模型中的分化細(xì)胞，而ADs來(lái)源于“自下而上”方式的增殖性干細(xì)胞。為了提供腫瘤起源的組織學(xué)證據(jù)，通過(guò)多重成像繪制了腫瘤細(xì)胞的位置。干細(xì)胞標(biāo)記OLFM4和SOX9在ADs中大量存在，但在HPs和SSL中顯著減少（圖3A和3B）。在正常結(jié)腸和ADs中檢測(cè)到核CDX2，但在HPs中減少，在SSLs中缺失（圖3C）。SSC標(biāo)記物MUC5AC在HPs和SSL中高表達(dá)，但在正?；顧z和ADs中不表達(dá)（圖3D）。細(xì)胞追蹤評(píng)分和WNT靶基因重疊確定了干細(xì)胞分支，與ASC共享，表明異常擴(kuò)增的干細(xì)胞是ADs的起源（圖3E）。與此形成鮮明對(duì)比的是，推測(cè)SSC是由吸收祖細(xì)胞和結(jié)腸細(xì)胞發(fā)育而來(lái)。對(duì)單個(gè)腫瘤的RNA速度分析基本上證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)（圖3F）。在正常標(biāo)本中，速度載體起源于干細(xì)胞，并流入分化的細(xì)胞類型。ASC被認(rèn)為是由干細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的，但SSC的速度向量是相反的，這表明這些細(xì)胞的起源是非干細(xì)胞。

惡性CRC細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示了實(shí)質(zhì)性的腫瘤間變異性（圖4A）。結(jié)合癌前數(shù)據(jù)，隨著上皮細(xì)胞從正常細(xì)胞向癌前細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞，觀察到腫瘤間異質(zhì)性增加。通過(guò)使用來(lái)自ADs和SERs的預(yù)先鑒定的基因集，觀察到MSS和MSI-H CRC細(xì)胞都保留其各自前體的部分。比較兩種亞型，MSS CRC細(xì)胞過(guò)度表達(dá)再生干細(xì)胞的特征，MSI-H CRC細(xì)胞保留化生特征（圖4B和4C）。為了進(jìn)一步支持癌癥前期和癌癥之間的共性，按照分子亞型（CMS）對(duì)ASC、SSC和CRC細(xì)胞進(jìn)行分類（圖4D）。ASCs和MSS CRC細(xì)胞對(duì)CMS2評(píng)分較高，CMS2是最常與WNT通路失調(diào)相關(guān)的亞型。相反，SSC和MSI-H CRC細(xì)胞在CMS2中得分較低，但在CMS1和CMS3中得分較高，這兩種細(xì)胞分別具有免疫原性和RAS通路激活。作者還研究了從癌前病變向惡性腫瘤轉(zhuǎn)變過(guò)程中獲得或丟失的特征。與SSC相比，MSI-H CRC細(xì)胞顯示出相對(duì)減少的化生特征。然而，與干細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵基因相比，WNT-SSC被激活。細(xì)胞追蹤分析表明MSI-H CRC細(xì)胞比SSC具有更高的干細(xì)胞潛能，而MSS CRC細(xì)胞的得分也高于ASC（圖4E）?；蛘{(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析更清楚地證明了在惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中分子途徑是如何維持或改變的，這一點(diǎn)得到了GSEA的支持（圖4F-4I）。與息肉相比，兩種CRC亞型都激活了它們的增殖超級(jí)調(diào)節(jié)子，并豐富了DNA合成和修復(fù)程序（圖4F-4I）。WNT信號(hào)超級(jí)調(diào)節(jié)子在ASC和MSS CRC細(xì)胞中持續(xù)上調(diào)（圖4F和4G）。對(duì)于MSI-H CRC細(xì)胞，描述SSC中病原體損傷反應(yīng)的超級(jí)調(diào)節(jié)子被抑制，但先前在SERs中被抑制的WNT信號(hào)超級(jí)調(diào)節(jié)子被激活（圖4H和4I）。這些結(jié)果表明MSI-H CRC通過(guò)轉(zhuǎn)化為更具攻擊性的干細(xì)胞樣細(xì)胞而獲得非化生的功能。

作者進(jìn)一步查詢了來(lái)自TCGA的63個(gè)批量RNA序列數(shù)據(jù)集，并驗(yàn)證了CMS亞型與化生性特征之間的關(guān)聯(lián)。然而，在單個(gè)腫瘤的基礎(chǔ)上，這些數(shù)據(jù)比scRNA-seq數(shù)據(jù)更具噪聲性，可能是由于數(shù)據(jù)質(zhì)量差和額外的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性造成的。引人注目的是，沒(méi)有一個(gè)MSS CRC（0/17）對(duì)MUC5AC呈陽(yáng)性，但大多數(shù)MSIH CRC（13/14）呈陽(yáng)性（圖5A和5B）。然而，在陽(yáng)性的MSI-H CRC中，MUC5AC染色的腫瘤面積是可變的。CDX2染色呈相反趨勢(shì)；實(shí)際上，MSS CRC中的所有腫瘤細(xì)胞均為CDX2陽(yáng)性，MSI-H CRC的CDX2染色有不同程度的減少。干細(xì)胞標(biāo)記物（OLFM4，SOX9）在整個(gè)MSS CRC中表達(dá)，并且它們一致缺乏MUC5AC表達(dá)（圖5C和5D）。相反，MSI-H CRC顯示出相當(dāng)大的腫瘤內(nèi)MUC5AC異質(zhì)性，在MSI-H CRC的某些區(qū)域染色較低；這些區(qū)域?qū)LFM4和某種程度的CDX2呈陽(yáng)性（圖5E-5H）。對(duì)單個(gè)scRNA序列數(shù)據(jù)集的集中分析驗(yàn)證了這些結(jié)果。MUC5AC和MSLN陽(yáng)性表達(dá)，再加上CDX2表達(dá)缺失，使同一腫瘤內(nèi)的化生細(xì)胞與LGR5/b-連環(huán)蛋白表達(dá)的增殖性干細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖5I、4C和4E）。

由于SERs未顯示超突變，而MSIH CRC顯示超突變，作者試圖確定SERs在早期是否具有獨(dú)特的腫瘤微環(huán)境。結(jié)合對(duì)來(lái)自癌前病變和CRC的非上皮性scRNA-seq數(shù)據(jù)的分析，并根據(jù)標(biāo)記基因表達(dá)及其在腫瘤亞型之間的組成變化確定不同的細(xì)胞類型（圖6A和6B）。與正常組織相比，大多數(shù)免疫細(xì)胞類型在息肉中增加，包括CD4 T細(xì)胞，盡管許多在息肉亞型之間沒(méi)有差異（圖6C）。AD衍生的與正常結(jié)腸CD4 T細(xì)胞相比，F(xiàn)OXP3調(diào)節(jié)子活性更高，這與一定程度的Treg依賴性免疫抑制一致（圖6D）。ASC表達(dá)吸引單核細(xì)胞的趨化因子信號(hào)，而SSC表達(dá)吸引淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子信號(hào)，這對(duì)建立適應(yīng)性免疫環(huán)境很重要（圖6E）。與ASC相比，SSC中的抗原處理和呈遞基因特征顯著更高，MSI-H CRC細(xì)胞中的抗原處理和呈遞基因特征也比MSS CRC細(xì)胞高（圖6E）。這些數(shù)據(jù)表明，從癌前到癌癥，一些適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的持續(xù)存在似乎與超突變無(wú)關(guān)。多重成像顯示，與ADs相比，SERs具有更高數(shù)量的T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞和更高比例的CD8 與CD4 T細(xì)胞（圖6F和6G），而其他免疫細(xì)胞群沒(méi)有顯著差異。骨髓樣細(xì)胞的豐度在scRNA-seq和成像上沒(méi)有差異，但CD68 巨噬細(xì)胞分布在整個(gè)AD基質(zhì)中，而它們集中在SERs的管腔表面，與MUC5AC 化生細(xì)胞的表面位置一致（圖6H）。在MUC5AC 化生區(qū)CD8 T細(xì)胞顯著富集，在OLFM4 區(qū)CD8 T細(xì)胞數(shù)量減少（圖6I）。相比之下，MSS CRC在整個(gè)腫瘤中的T細(xì)胞較少，它們均勻地由OLFM4 干細(xì)胞樣細(xì)胞組成（圖6I）。這些結(jié)果加強(qiáng)了SERs的化生起源與細(xì)胞毒性免疫微環(huán)境之間的聯(lián)系。

為了確定鋸齒狀腫瘤發(fā)生中的細(xì)胞毒性反應(yīng)是否是超突變前腫瘤細(xì)胞狀態(tài)的固有因素，使用了模擬早期腫瘤發(fā)生事件的基因工程小鼠。Lrig1^CreERT2/ ；Apc^2lox14/ 是AD通路的模型，導(dǎo)致遠(yuǎn)端結(jié)腸腺瘤性腫瘤。驅(qū)動(dòng)Braf激活突變不會(huì)導(dǎo)致肉眼可見(jiàn)的腫瘤，但會(huì)導(dǎo)致近端結(jié)腸絨毛狀化生（圖7A）。與對(duì)照正常結(jié)腸相比，Apc突變腫瘤的b-連環(huán)蛋白染色升高，CD8 T細(xì)胞數(shù)量減少，這與人類ADs和MSS CRC一致。相比之下，Braf突變病變與CD8 T細(xì)胞浸潤(rùn)增加相關(guān)，明顯的是，僅在分化細(xì)胞室中，而在突變隱窩中沒(méi)有（圖7B和7C）。使用免疫染色和轉(zhuǎn)錄組學(xué)，確定Mist1 細(xì)胞代表結(jié)腸隱窩基底外的一個(gè)細(xì)胞子集。重要的是，Mist1 細(xì)胞通過(guò)Apc的雙等位基因重組（Mist1^CreERT2/ ；Apc^{2lox14/2lox14}）引發(fā)結(jié)腸腫瘤（簡(jiǎn)稱Mist1腫瘤），隨后發(fā)生2.5%的DSS損傷，代表了一種非干細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的腫瘤模型。每只小鼠近端結(jié)腸與遠(yuǎn)端結(jié)腸的Mist1腫瘤發(fā)生率為7:1（圖7D和7E），這與Lrig1^CreERT2/ 中腫瘤的遠(yuǎn)端結(jié)腸優(yōu)勢(shì)不同。為了解釋這兩種腫瘤類型的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)腫瘤組織和對(duì)照結(jié)腸進(jìn)行了scRNA-seq，并鑒定了腫瘤特異性細(xì)胞，包括異常的Paneth細(xì)胞（圖7F-7H）。由于一種常見(jiàn)的WNT驅(qū)動(dòng)的突變過(guò)程，來(lái)自兩種腫瘤類型的腫瘤特異性細(xì)胞（TSC）形成了一個(gè)Lgr5過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞群，而沒(méi)有化生基因特征（圖7G-7I）。此外，兩種腫瘤類型的b-連環(huán)蛋白染色均升高，反映WNT被激活（圖7E）。雖然腫瘤類型之間的突變過(guò)程相同，但作者發(fā)現(xiàn)免疫微環(huán)境存在顯著差異。Mist1腫瘤與SERs類似，含有較高比例的CD8 T細(xì)胞（圖7J-7M）。這些細(xì)胞表達(dá)活性細(xì)胞毒性和殺傷效應(yīng)物的標(biāo)記物（圖7N）。Lrig1腫瘤具有明顯的功能失調(diào)的CD4 T細(xì)胞群（圖7J-7M）。這些細(xì)胞表達(dá)免疫抑制標(biāo)記物，如Pdcd1（PD1）、Ctla4、Prdm1和Havcr2（TIM3），以及Foxp3調(diào)節(jié)子基因，表明功能失調(diào)的T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)特性（圖7N）。多重成像顯示，與Lrig1腫瘤相比，Mist1腫瘤中浸潤(rùn)C(jī)D8 T細(xì)胞的腫瘤數(shù)量顯著增加，但CD4 T細(xì)胞的數(shù)量不明顯（圖7O和7P）。為了將上皮干細(xì)胞與微環(huán)境差異聯(lián)系起來(lái)，應(yīng)用細(xì)胞追蹤顯示Lrig1 TSC具有顯著更高的推斷干細(xì)胞潛能，并且比Mist1 TSC表達(dá)更多的干細(xì)胞和分化程度更低的細(xì)胞基因（圖7Q）。反過(guò)來(lái)，Lrig1腫瘤細(xì)胞在形成類器官方面明顯比MIST 1腫瘤細(xì)胞更成功（圖7R）。從先前定義與免疫細(xì)胞相互作用相關(guān)的正常腸道干細(xì)胞的干細(xì)胞梯度（ISCI>ISCI>ISCII）的工作中，發(fā)現(xiàn)Lrig1 TSC表現(xiàn)出較高的ISCI分?jǐn)?shù)，而Mist1 TSC表現(xiàn)出較高的ISCI和ISCII分?jǐn)?shù)（圖7S）。與ISCII和ISCII增加的抗原呈遞能力一致，Mist1 TSC也增加了抗原呈遞機(jī)制的表達(dá)（圖7T和7U）。Mist1類腫瘤細(xì)胞比Lrig1類腫瘤細(xì)胞處理和表達(dá)更多的抗原，這通過(guò)DQ-OVA的內(nèi)吞作用和蛋白水解以及I-A/I-E染色反映，表明表面抗原表達(dá)（圖7V）。為了支持這一觀察，與Lrig1類腫瘤相比，Mist1類腫瘤在呈現(xiàn)OVA肽時(shí)刺激T細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng)（圖7W）；與正常遠(yuǎn)端結(jié)腸相比，在Lrig1類腫瘤中觀察到這種作用受到抑制。與ADs相比，人類類腫瘤分析顯示人類SERs中的干細(xì)胞容量降低，同時(shí)抗原呈遞基因特征增加（圖6E）。

本研究作者提出了一個(gè)多組學(xué)人類癌前圖譜，該圖譜整合了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)和免疫組織病理學(xué)，描述了兩種最常見(jiàn)的結(jié)直腸癌途徑。確定并在功能上驗(yàn)證了建立不同腫瘤景觀的不同起源和分子過(guò)程。值得注意的是，只有通過(guò)對(duì)CRC原始病變的觀察，才能更清楚地了解晚期和高度異質(zhì)性癌癥，從而為精確預(yù)防、監(jiān)測(cè)和治療的新策略鋪平道路。

教授介紹

Ken S. Lau博士就職于范德堡大學(xué)，實(shí)驗(yàn)室的中心目標(biāo)是了解炎癥微環(huán)境，是如何向上皮細(xì)胞發(fā)出信號(hào)以改變其表型的。微環(huán)境信號(hào)被精確調(diào)節(jié)，以限制和維持上皮細(xì)胞、管腔微生物和潛在免疫細(xì)胞之間的穩(wěn)態(tài)。平衡失調(diào)會(huì)導(dǎo)致炎癥性腸病和結(jié)直腸癌等疾病。Ken S. Lau博士利用單細(xì)胞方法，如解剖細(xì)胞因子（Simmons et al.，2015）、多重成像（MxIF）（McKinley et al.，2017）和單細(xì)胞RNA序列來(lái)查詢單細(xì)胞狀態(tài)。Ken S. Lau博士的目標(biāo)是在體內(nèi)揭示上皮細(xì)胞群體（如癌癥干細(xì)胞）的異質(zhì)性和可塑性程度，并將這些知識(shí)轉(zhuǎn)化為治療上可處理的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

Chen B, Scurrah CR, McKinley ET, et al. Differential pre-malignant programsand microenvironment chart distinct paths to malignancy in human colorectalpolyps. Cell. 2021;S0092-8674(21)01381-7. doi:10.1016/j.cell.2021.11.031

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