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本文對(duì)單一小分子化合物（多組分化合物除外）的結(jié)構(gòu)確證相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行梳理概括。 小分子化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證的一般順序單一組分化合物通常是定向合成、天然產(chǎn)物提取、發(fā)酵提取或半制備等方式制備得到，通過(guò)液相或氣相等檢測(cè)手段評(píng)估純度（原料藥純度通?！?9.0%；雜質(zhì)純度通常≥90.0%）后，主要通過(guò)核磁共振氫譜（1H-NMR）、光譜及常規(guī)質(zhì)譜（MS）等方法，基于合成機(jī)理推斷平面結(jié)構(gòu)；如合成機(jī)理不明確，采用提取方式獲得，或氫譜及質(zhì)譜等常規(guī)方法對(duì)化合物結(jié)構(gòu)判斷的信息作用不大，則需要投入更多確證方法來(lái)輔助結(jié)構(gòu)判斷，如借助碳譜（13C-NMR），二維核磁等來(lái)確證；在解析得到平面結(jié)構(gòu)后，如判斷存在立體構(gòu)型，應(yīng)采用針對(duì)立體結(jié)構(gòu)相應(yīng)的研究手段，如NOESY、圓二色譜（CD）、單晶衍射等進(jìn)行確證。
小分子化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證的研究手段化合物結(jié)構(gòu)初步確證后，按照相關(guān)指導(dǎo)原則，筆者根據(jù)化合物類別，對(duì)原料藥（新化學(xué)實(shí)體、已知化合物）、起始物料/中間體/雜質(zhì)（新化合物、已知化合物）結(jié)構(gòu)確證的相關(guān)研究?jī)?nèi)容列表整理如下[1~3]。
表1 不同類別化合物的結(jié)構(gòu)確證方法判斷
結(jié)構(gòu)確證經(jīng)驗(yàn)總結(jié)下文是筆者對(duì)曾用到的結(jié)構(gòu)確證相關(guān)技術(shù)進(jìn)行的簡(jiǎn)單闡述，因結(jié)構(gòu)解析是一門系統(tǒng)的學(xué)科，內(nèi)容較多且精深，在此不做具體結(jié)構(gòu)解析的陳述。
3.1 高分辨質(zhì)譜（HRMS）/質(zhì)譜（MS）與常規(guī)質(zhì)譜相比，高分辨質(zhì)譜（HRMS）測(cè)得化合物的分子量可精確至小數(shù)點(diǎn)后第四位，常用于輔助確定化合物的分子質(zhì)量和和分子式，前提是通過(guò)核磁共振波譜已初步確定化合物結(jié)構(gòu)。某些情況下，質(zhì)譜可以起到結(jié)構(gòu)確證的關(guān)鍵作用。筆者曾解析一新化合物，在初步推斷得到平面結(jié)構(gòu)后，發(fā)現(xiàn)分子量與推斷的結(jié)構(gòu)不一致。仔細(xì)觀察質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，在分子離子峰右側(cè)還有一M+2的離子峰（豐度比約3:1），才恍然醒悟分子結(jié)構(gòu)中含有氯原子，新化合物結(jié)構(gòu)得以破解。鹵素常有同位素峰，分子結(jié)構(gòu)中存在的氯（Cl）和溴（Br）較典型，當(dāng)分子中含有1個(gè)氯或溴時(shí)，相對(duì)豐度比分別為3:1或1:1；含有多個(gè)氯或溴時(shí)，筆者一般是手動(dòng)計(jì)算，或采用Chemdraw中的Analysis m/z值來(lái)判斷。質(zhì)譜解析中還有一條大家都比較熟悉的“氮規(guī)則”：化合物分子不含氮或含偶數(shù)個(gè)氮原子時(shí)，其分子離子的質(zhì)量是偶數(shù)；化合物分子含奇數(shù)個(gè)氮原子時(shí)，其分子離子的質(zhì)量是奇數(shù)。元素分析對(duì)化合物中的各元素進(jìn)行含量測(cè)定，確定各元素的百分含量。針對(duì)各元素的特點(diǎn)，元素分析可選擇的方法較為多樣。碳、氫、氮元素檢測(cè)通常采用燃燒分解法；含鹵素或硫的化合物，采用氧瓶燃燒-滴定法（中國(guó)藥典2020年版四部通則0703）；金屬元素可采用電感耦合等離子發(fā)射光譜法（ICP-OES）；磷元素可采用酸分解-比色法等。測(cè)定完畢，比較測(cè)試結(jié)果與理論結(jié)果差值的大小，指導(dǎo)原則[1]規(guī)定“一般要求誤差不超過(guò)0.3％”，在實(shí)際遇到的一些案例中，會(huì)存在樣品容易吸潮或化合物含較多游離水，導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果與理論結(jié)果誤差超過(guò)0.3%。在元素分析解析時(shí)，建議元素百分含量測(cè)定值扣除化合物的水分測(cè)定結(jié)果后，再與理論值比較誤差。取化合物2mg~10mg裝入核磁管，用合適的氘代試劑進(jìn)行溶解，用核磁共振波譜儀（頻率通常400M~800M）進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)物為四甲基硅烷（TMS）。1H的天然豐度較13C高很多，核磁測(cè)試時(shí)，兩者頻率通常是4倍關(guān)系，如氫譜（1H
NMR）600M頻率對(duì)應(yīng)碳譜（13C
NMR）150M頻率；碳譜的響應(yīng)較氫譜低，如果化合物量較少，在測(cè)試碳譜時(shí)，可通過(guò)積累掃描時(shí)長(zhǎng)增加碳譜的響應(yīng)；分子量大的化合物較分子量小的化合物檢測(cè)用量要多。氘代試劑的選擇也非常關(guān)鍵，比較常見(jiàn)的氘代試劑有DMSO-d6，CDCl3，D2O，Methanol-d4，(CD3)2CO等。某些情況下，化合物的化學(xué)位移可能與氘代試劑（或氘代試劑中存在的水）在氫譜或碳譜中的化學(xué)位移重疊，影響結(jié)構(gòu)確證，就需要更換氘代試劑進(jìn)行測(cè)定。指導(dǎo)原則[1]規(guī)定“對(duì)含有活潑氫的藥物必需進(jìn)行氘代實(shí)驗(yàn)，以提供活潑氫的存在以及位置的信息?！?，選擇氘代試劑時(shí)，可采用重水交換來(lái)確認(rèn)活潑氫的存在。同時(shí)，可結(jié)合二維1H-1H COSY譜進(jìn)行確認(rèn)。核磁出圖后，研發(fā)人員常用MestRenova軟件對(duì)圖譜進(jìn)行化學(xué)位移和積分處理，采用Chemdraw軟件預(yù)測(cè)化合物的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)，輔助判斷平面結(jié)構(gòu)。如果化合物為已知化合物，通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道的氫譜（1H NMR）或碳譜（13C NMR）數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，則較易解析。微譜數(shù)據(jù)庫(kù)可進(jìn)行檢索查新，目前數(shù)據(jù)庫(kù)中已收載137萬(wàn)多種化合物的碳譜數(shù)據(jù)，為植物化學(xué)或天然產(chǎn)物研發(fā)工作者提供了較大的便利。只需在微譜數(shù)據(jù)庫(kù)中錄入已獲得的碳譜數(shù)據(jù)，則能很快獲得文獻(xiàn)已發(fā)表化合物和待解析化合物的相似度。該數(shù)據(jù)庫(kù)需要收費(fèi)[4]。除了氫譜（1H
NMR）和碳譜（13C
NMR），DEPT（無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)技術(shù)）和APT（碳連氫譜）也是一維核磁波譜。DEPT和APT譜用得較少，它們的作用是判斷碳的類型。普通13C-NMR出的化學(xué)位移棒均是“朝上（正）”，DEPT和APT譜出的化學(xué)位移棒“有上（正）有下（負(fù)）”，常用135°DEPT。在135°DEPT實(shí)驗(yàn)中所有的季碳都不出峰，伯、叔碳為正（棒朝上），仲碳為負(fù)（棒朝下）。APT譜中季碳可以出峰，信號(hào)強(qiáng)度較DEPT譜增加。二維核磁共振波譜是對(duì)平面結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證的關(guān)鍵。常用的為：HMBC（檢出1H異核多鍵相干技術(shù)）、HSQC（檢出1H異核單量子相干技術(shù)）、COSY（同核位移相關(guān)譜）、NOESY（核極化效應(yīng)相關(guān)譜）。HMBC對(duì)推斷結(jié)構(gòu)最為高效，它是看相隔2個(gè)或3個(gè)鍵氫原子與碳原子的遠(yuǎn)程相關(guān)性；COSY（通常是1H-1HCOSY）看相鄰碳相連氫原子的相關(guān)性；HSQC看直接相連的碳?xì)湎嚓P(guān)性。通常通過(guò)這三種技術(shù)，即可初步確認(rèn)化合物的平面結(jié)構(gòu)。JNP（Journalof
Natural
Products）雜志近期發(fā)表的某新的萜類化合物1的平面結(jié)構(gòu)推斷見(jiàn)圖1，紅色箭頭表示的是根據(jù)HMBC譜推斷的碳?xì)湎嚓P(guān)性，藍(lán)色粗線表示的是1H-1H
COSY譜推斷的氫氫相關(guān)性。該化合物平面結(jié)構(gòu)確證后，其相對(duì)構(gòu)型通過(guò)NOESY譜進(jìn)行確定，NOESY譜上可反映空間上的氫氫相關(guān)性，見(jiàn)圖2，黑色箭頭標(biāo)出了空間氫原子相關(guān)。詳細(xì)的解析過(guò)程和核磁共振圖譜數(shù)據(jù)可查詢參考文獻(xiàn)[5]。
圖1 新化合物1平面結(jié)構(gòu)（紅色箭頭：HMBC；藍(lán)色粗線：key COSY）
圖2 新化合物1空間NOE相關(guān)性（黑色箭頭：NOESY）圓二色譜（CD）是用于推斷非對(duì)稱分子的構(gòu)型和構(gòu)象的一種旋光光譜，可用于確證化合物的絕對(duì)構(gòu)型。上述新化合物1在通過(guò)二維核磁波譜確定了平面結(jié)構(gòu)和相對(duì)構(gòu)型后，通過(guò)圓二色譜計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的擬合（見(jiàn)圖3），最終確定了其絕對(duì)構(gòu)型。
單晶X-射線衍射（XRSD）也是確定絕對(duì)構(gòu)型的常用方法，可測(cè)定晶態(tài)分子的晶胞參數(shù)、晶系、空間群，可提供一個(gè)化合物在晶態(tài)中所具有原子的精確空間位置。該技術(shù)主要涉及單晶培養(yǎng)和檢測(cè)。晶體培養(yǎng)難度較大，需不斷嘗試且有足夠耐心。劍橋晶體數(shù)據(jù)中心（CCDC,
the Cambridge Crystallographic Data
Centre）自1965年起就從事晶體數(shù)據(jù)的收集、整理與計(jì)算機(jī)化工作，該中心發(fā)展的劍橋結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)CSDS(CSDS，the
Cambridge Structural Database
System)是基于X光和中子衍射實(shí)驗(yàn)唯一的小分子及金屬有機(jī)分子晶體的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（網(wǎng)址：https://www.ccdc./structures/），其中收錄了113萬(wàn)多化合物的晶體結(jié)構(gòu)，每一個(gè)化合物均有自己的CCDC編號(hào)[6]。圖4是新化合物2的熱橢圓形點(diǎn)圖（ORTEP圖）和CCDC數(shù)據(jù)庫(kù)收錄（CCDC編號(hào)：2048214）的3D動(dòng)態(tài)模擬圖截圖[5]。
圖4 新化合物2的ORTEP圖及CCDC（編號(hào)：2048214）收錄的3D動(dòng)態(tài)模擬圖截圖3.7 其他結(jié)構(gòu)確證技術(shù)除上述結(jié)構(gòu)確證方法外，還有很多其他的結(jié)構(gòu)確證技術(shù)，如紅外、紫外、拉曼光譜、熱重分析（TG）、差示掃描量熱法（DSC）、旋光光譜等。紅外光譜、熱重分析（TG）、差示掃描量熱法（DSC）、偏光顯微鏡法等對(duì)化合物晶型的判斷也可起到輔助作用。某些化合物在固態(tài)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出多晶型，多晶型會(huì)表現(xiàn)出紅外光譜的差異；通常，結(jié)構(gòu)中微小的差別會(huì)使紅外光譜有很明顯的差別[7]。老藥組胺H2受體阻抗劑“西咪替丁”，參比制劑使用的原料藥為A晶型，其原料藥還存在另外三種晶型B、C、D，此外還有混合晶型。ABCD這四種晶型在紅外光譜中的吸收存在微小差異（見(jiàn)下表），根據(jù)這些差異，可采用紅外光譜來(lái)對(duì)A晶型產(chǎn)品進(jìn)行鑒別[8]。此外，DSC也顯示A晶型和B晶型在起始熔點(diǎn)和最高吸熱峰存在差異，可用于晶型鑒別[9]。
本文對(duì)小分子化合物的結(jié)構(gòu)確證方法進(jìn)行了初步匯總，實(shí)際工作中，因化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異，對(duì)結(jié)構(gòu)確證技術(shù)方法的選擇和應(yīng)用應(yīng)仔細(xì)剖析后使用。
[1] 化學(xué)藥物原料藥制備和結(jié)構(gòu)確證研究技術(shù)指導(dǎo)原則（2005年）[2] 手性藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則（2006年）[3] 新藥 I 期臨床試驗(yàn)申請(qǐng)技術(shù)指南（2018年）[4] 微譜數(shù)據(jù)網(wǎng)（http://www./）[5] Terpenoids
from the Marine-DerivedFungus Aspergillus sp. RR-YLW-12, Associated
with the Red Alga Rhodomelaconfervoides [J]. Journal of
NaturalProducts, 2021, 84, 6:1763-1771.[6] 劍橋結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)CSDS（https://www.ccdc./）[7] 中國(guó)藥典2020年版四部通則0400光譜法[8] Bela
Hegedüs, Sándor Gorog. The polymorphismof cimetidine[J]. Journal of
Pharmaceutical & Biomedical Analysis,1985, 3(4):303-313.[9] 尹華, 楊臘虎, 等. 西咪替丁的晶型研究[J]. 藥物分析雜志, 2001, 21(1):39-42.
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