手性分子絕對構(gòu)型的確定是一個極其重要且長期存在的問題。目前確定手性分子絕對構(gòu)型的方法主要有四類：(1) 有機化學(xué)法；(2) 核磁共振法；(3) X射線衍射法；(4) 光譜法，如旋光光譜法、圓二色譜、振動圓二色譜等。

1. 有機化學(xué)法

有機合成是最早的確定分子手性的方法，主要為化學(xué)相關(guān)法。即將目標(biāo)分子反合成分析，從初始已知手性的化合物開始，通過手性控制的有機化學(xué)反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為目標(biāo)化合物的方法，然后從他們旋光符號或者相應(yīng)的氣相色譜、液相色譜推導(dǎo)出其絕對構(gòu)型。很多富有挑戰(zhàn)性的復(fù)雜手性化合物的合成如今已被有機化學(xué)家們所攻克，然而有機合成始終是一項繁瑣而辛苦的選擇。

2. 核磁共振法（NMR）

NMR 技術(shù)是獲的化合物結(jié)構(gòu)的首選方法，其耦合常數(shù)和NOE譜圖是獲取化合物相對構(gòu)型的重要手段，適用于剛性結(jié)構(gòu)非對映體的構(gòu)型確認。但是對于光學(xué)（對映）異構(gòu)體而言，一般情況下其NMR譜的信號是相同的，即應(yīng)用NMR 譜無法直接將其區(qū)分，也不能確定其絕對構(gòu)型。近年來發(fā)展了一些間接方法，借助NMR法，通過手性樣品的衍生物來測定對映異構(gòu)體的絕對構(gòu)型。

在應(yīng)用NMR法測定手性化合物絕對構(gòu)型的方法中，以Mosher 法最為常用。即通過將樣品衍生化為非對映異構(gòu)體或類似于非對映體，測定樣品分子與手性試劑反應(yīng)后產(chǎn)物的¹H-NMR 或¹³C-NMR 位移數(shù)據(jù)，得到其化學(xué)位移的差值并與模型比較，最后推定底物分子手性中心的絕對構(gòu)型。例如，Mosher法是將待測樣品的手性仲醇基（或仲胺基）與(R)或(S)-α-甲氧基-α-三氟甲基-α-苯基乙酸（亦稱Mosher 酸，縮寫MTPA，見圖1）反應(yīng)生成相應(yīng)的酯或酰胺，然后測定該酯或酰胺的核磁共振氫譜。根據(jù)MTPA芳香環(huán)的屏蔽效應(yīng)，比較待測物與MTPA成酯（或酰胺）前后¹H-NMR 或¹³C-NMR信號的化學(xué)位移差，由譜中化學(xué)位移的差值和模型圖來推測仲醇（或仲胺基）的絕對構(gòu)型。

圖1Mosher酸的立體構(gòu)象

手性衍生物的NMR法的樣品用量少，衍生物合成簡單，測定迅速、準(zhǔn)確，在手性醇、手性胺、手性羧酸的絕對構(gòu)型確定中已經(jīng)非常成熟。由于目前所開發(fā)的手性識別劑主要針對于手性中心中的某些基團（如羥基、氨基、羧酸），并且需要昂貴的手性試劑進行衍生化，其應(yīng)用范圍有所局限。

3. X-射線衍射法（X-raydiffraction）

普通的X-射線法（鉬靶）僅能構(gòu)筑化合物的相對構(gòu)型，不能區(qū)分對應(yīng)異構(gòu)體。如果分子中含有重原子（一般原子序數(shù)大于16）或在分子中引入一個重原子，就可用X-射線來測定該重原子的手性分子絕對構(gòu)型。此外，通過引入另一個已知絕對構(gòu)型的手性分子也可獲得結(jié)構(gòu)的絕對構(gòu)型。隨著技術(shù)的發(fā)展，采用CuKa作為入射光源的X-射線單晶CCD衍射儀，對于測定相對分子量在1000以下、含C、H、N、O原子有機分子的絕對構(gòu)型已可實現(xiàn)了。

在單晶結(jié)構(gòu)分析中，目前國際公認表征絕對構(gòu)型的參數(shù)稱為Flack 參數(shù)，當(dāng)結(jié)構(gòu)分析進入到最后的精修階段時，如果該參數(shù)等于或接近0，或其參數(shù)在± 0.3之內(nèi)，那么一般認為絕對構(gòu)型就被確定了。

采用單晶X-衍射法樣品用量少、測定迅速、結(jié)果可靠直觀，可以作為最終的立體構(gòu)型的確定方法。但是由于測試的儀器價格昂貴，對單晶有嚴格要求，也限制了X-射線衍射法的應(yīng)用。

4.  光譜法

在光譜分析方法中，現(xiàn)有最有名和應(yīng)用最廣泛的手性分子構(gòu)型確定法為旋光光譜法(ORD) 和圓二色譜法 (CD)，該法對樣品要求不高 (如純度、官能團、結(jié)晶等)、測量過程無損失，因而得到了廣泛應(yīng)用。近幾年，振動圓二色譜法(VCD) 取得了巨大的發(fā)展，逐漸成為一項鑒定手性分子絕對構(gòu)型的重要工具。

4.1  旋光光譜法（ORD）

早期的手性光學(xué)法是旋光譜法。當(dāng)平面偏振光通過手性物質(zhì)時， 能使其偏振面發(fā)生旋轉(zhuǎn)，這種現(xiàn)象稱之為旋光。 用儀器記錄通過手性化合物溶液的平面偏振光的振動面偏轉(zhuǎn)的角度，即為旋光度α，我們平常所測定的旋光即為波長在589.6 nm的Na燈的黃光下的比旋光度。旋光度隨波長的變化而變化就可獲得旋光光譜(ORD)。

在同系物中，相同的化學(xué)反應(yīng)使旋光值按相同的方向改變，而不改變其旋光的方向，因此通過比較相關(guān)化合物的旋光性，可得到手性化合物的構(gòu)型信息。在采用該方法測定藥物絕對構(gòu)型時，應(yīng)與絕對構(gòu)型已知且與待測藥物結(jié)構(gòu)相同或相似化合物，在相同的實驗條件下測定旋光光譜，以保證比較結(jié)果的可靠性。

相比圓二色譜法（CD）而言，CD譜形尖銳、簡單明了、易于分析，ORD現(xiàn)已被現(xiàn)代手性光學(xué)技術(shù)CD所取代。

4.2  圓二色譜法 (CD)

傳統(tǒng)的圓二色譜所用的平面偏振光的波長范圍一般在紫外區(qū)（200～400 nm）。手性化合物（溶液）在左旋和右旋圓偏振光的吸收系數(shù)(ε)之差隨入射偏振光波長的改變而改變, 得到的圖譜即是圓二色光譜（CD），又稱為電子圓二色譜(ECD)。

該方法主要是通過測定光學(xué)活性物質(zhì)（待測物）在圓偏振光下的Cotton效應(yīng)，根據(jù)Cotton效應(yīng)的符號獲得藥物結(jié)構(gòu)中發(fā)色團周圍環(huán)境的立體化學(xué)信息，并與一個絕對構(gòu)型已知的與待測藥物結(jié)構(gòu)相似化合物的Cotton效應(yīng)相比較，或者借助計算化學(xué)的方法，對比實驗測值和理論計算值，即可能推導(dǎo)出待測物的絕對構(gòu)型。圖2為鋨雜苯手性化合物1A和1B的結(jié)構(gòu)及其CD譜圖。

圖2 鋨雜苯手性化合物1A和1B及其CD譜,

(a)1A和1B的化學(xué)結(jié)構(gòu)；(b)1A和1B的CD譜實測值；

長期以來，電子圓二色譜由于其干擾少、容易測定而被廣泛應(yīng)用。但該法使用的前提條件是待測化合物的手性中心含有合適的發(fā)色團（有紫外吸收），或者能夠引進合適的發(fā)色團。對于手性中心無發(fā)色團或無法引入發(fā)色團的化合物，則不適宜采用該方法。

4.3  振動圓二色譜法 (VCD)

傳統(tǒng)的圓二色譜要求手性分子必須有紫外吸收，這一點成為限制其應(yīng)用的重大問題。在20世紀(jì)70年代，Holzwart，Nafie和Stephens等先后成功測定了紅外光區(qū)頻率下的圓二色譜，即振動圓二色譜(VCD)。當(dāng)平面偏振光的波長范圍在紅外區(qū)（4000～750 cm?1）時，由于其吸收光譜是分子的振動轉(zhuǎn)動能級躍遷引起的，VCD譜即為紅外光中的左旋圓偏光和右旋圓偏光的吸收系數(shù)之差?ε隨波長變化所給出的圖譜。

 由于振動光譜譜圖的復(fù)雜性, VCD很難象傳統(tǒng)圓二色譜 (electronic circular dichroism, ECD)那樣發(fā)展出合適的理論來進行結(jié)構(gòu)-譜圖的對應(yīng)解釋，主要依靠理論計算值和實測值對比來判斷手性分子的絕對構(gòu)型。

與ECD相比，VCD的最大優(yōu)勢就是不需要分子中含有生色團 (紫外吸收)，幾乎所有手性分子都在紅外區(qū)有吸收，都會產(chǎn)生VCD譜圖。此外，VCD測試是在溶液狀態(tài)測定，不需要單晶，樣品中的非手性雜質(zhì)也不影響測定結(jié)果。隨著越來越多的關(guān)注和研究，振動圓二色譜法將成為一項鑒定手性分子絕對構(gòu)型的強有力的工具。

除上述的四大經(jīng)典構(gòu)型確定法外，紅外光譜、紫外光譜法也用于輔助測定化合物的構(gòu)型。更多的方法還望同行們共同探討總結(jié)。