基因工程中常用兩種限制酶酶切質(zhì)粒和目的基因，可以為防止錯(cuò)誤連接及自身環(huán)化、和反向鏈接。但實(shí)際操作中要考慮到目的基因兩端可能沒(méi)有兩種限制酶的酶切位點(diǎn)；若是人工合成需要人為的加上粘性末端。

2016·全國(guó)卷Ⅰ節(jié)選：某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問(wèn)題：

(2) 如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是  ①  ；并且  ② 和  ③ 的細(xì)胞也是不能區(qū)分的。其原因是 ④ 。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有  ⑤  的固體培養(yǎng)基。

答案：① 二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng); ②含有質(zhì)粒載體（空載）;③含有重組質(zhì)粒;④二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng);⑤四環(huán)素

解析：目的基因和載體有同一種酶酶切后，會(huì)形成相同的粘性末端，再用DNA鏈接酶催化時(shí)，會(huì)有下圖的三種情況。且上述題目中，目的基因插入破壞了四環(huán)素的抗性基因，因此導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的受體菌，可以在含有青霉素的培養(yǎng)基生長(zhǎng)，但不能在含有四環(huán)素的培養(yǎng)上生長(zhǎng)。

科學(xué)家將外源目的基因與大腸桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行重組，并在大腸桿菌中成功表達(dá)。如圖表示構(gòu)建重組質(zhì)粒和篩選含目的基因的大腸桿菌的過(guò)程。 請(qǐng)據(jù)圖回答問(wèn)題。

（1）圖中質(zhì)粒上有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素兩個(gè)標(biāo)記基因，經(jīng)過(guò)①和②步驟后，有些質(zhì)粒上的    基因內(nèi)插入了外源目的基因，形成重組質(zhì)粒，由于目的基因的分隔使得該抗性基因失活。

（2）步驟③是         的過(guò)程，為了促進(jìn)該過(guò)程，應(yīng)該用    處理大腸桿菌。

（3）步驟④將三角瓶?jī)?nèi)的大腸桿菌接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基Ｃ上培養(yǎng)，目的是篩選     ，能在Ｃ中生長(zhǎng)的大腸桿菌有    種

（4）步驟⑤：用無(wú)?。蒙系膯蝹€(gè)菌落，分別接種到Ｅ（含四環(huán)素），然后用影印法接種到D（含氨芐青霉素和四環(huán)素）上，一段時(shí)間后，菌落的生長(zhǎng)狀況如圖所示。含目的基因的   菌落位于    （填Ｄ或Ｅ）上，請(qǐng)?jiān)趫D中相應(yīng)的位置上圈出來(lái)。

答案（1）氨芐青霉素抗性；（2）將重組質(zhì)粒（目的基因）導(dǎo)入大腸桿菌（受體細(xì)胞）CaCl₂溶液；（3）含四環(huán)素抗性基因的大腸桿菌 ２ ；（4）E

2018浙江溫州3月選考模擬 利用圖示質(zhì)粒和目的基因培育轉(zhuǎn)基因醋化醋桿菌。圖中標(biāo)注了相關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn),其中酶切位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請(qǐng)回答下列有關(guān)轉(zhuǎn)基因的問(wèn)題:

(1)利用圖示質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒,應(yīng)選用　　　　  兩種限制酶切割。

解析：為防止錯(cuò)誤連接（包括反向鏈接）和自身環(huán)化應(yīng)采用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割。

2020年1月浙江高考29：為了提高目的基因和質(zhì)粒重組的成功率，選擇使用____________，對(duì)含目的基因的DNA片段進(jìn)行處理，使其兩端形成不同的粘性末端，對(duì)質(zhì)粒也進(jìn)行相同的處理，然后用DNA連接酶連接形成重組質(zhì)粒。通過(guò)在大腸桿菌中________，以獲得大量的重組質(zhì)粒，最終將其導(dǎo)入原生質(zhì)體中。

答案：兩種限制性核酸內(nèi)切酶  擴(kuò)增