我永遠(yuǎn)相信除了工作之外，一定要有自己的興趣和所愛，一定要堅持，因為那里才是誕生奇跡的地方。我會堅持一些東西，比如：“干細(xì)胞者說”。

 ----步步先生

撰文：東皇先生

來源：干細(xì)胞者說

自然界中，大多數(shù)高等動物新生命的開始都源于父親精子和母親卵子的結(jié)合。精卵細(xì)胞結(jié)合形成一個受精卵，新生命就這樣誕生了。在生殖過程中，單倍體生殖細(xì)胞（精子和卵細(xì)胞）負(fù)責(zé)將父代、母代遺傳信息傳遞給子代。

精子和卵子的各自起始細(xì)胞，便為生殖干細(xì)胞。作為成體干細(xì)胞的一種，生殖干細(xì)胞具有自我更新能力和向生殖細(xì)胞分化的能力，在維持自身數(shù)量的同時，不斷產(chǎn)生分化的生殖細(xì)胞，經(jīng)過減數(shù)分裂形成配子。

研究顯示，哺乳動物雄性生殖干細(xì)胞只占生殖細(xì)胞總數(shù)的0.02-0.03%，但這萬分之一左右的細(xì)胞，卻肩負(fù)著重要的任務(wù)，需要在一生的時間里產(chǎn)生成千上萬的精子[1]。正常男性一生大概能產(chǎn)生超過9520億成熟精子[1]。

而在雌性哺乳動物中，正常雌性一生只能產(chǎn)生相對稀少的數(shù)目的成熟卵子。如正常女性，一生中只能產(chǎn)生300-500顆成熟卵子。這是否意味著，雌性卵巢中不存在生殖干細(xì)胞，或者說生殖干細(xì)胞數(shù)量極其稀少呢？

要想全面了解“生殖干細(xì)胞 ”，我們先把雌性生殖干細(xì)胞的世紀(jì)爭論先放一放。先看一看，雄性和雌性生殖細(xì)胞，最初的來源是哪里？

我們先從小鼠胚胎發(fā)育開始，隨后介紹人類胚胎發(fā)育，去看生殖細(xì)胞的起源。

1）胚胎時期的生殖細(xì)胞

在小鼠胚胎發(fā)育過程中，在E7天原腸胚時期開始出現(xiàn)生殖細(xì)胞的祖細(xì)胞：原始生殖細(xì)胞PGC（Primordian Germ Cell）。

E7天是什么意思？就是指胚胎發(fā)育的第七天，從受精卵形成開始計時。大家都聽說過大名鼎鼎的胚胎干細(xì)胞，其具有多能性，能分化成各種類型的細(xì)胞，這個大佬就是在E3.5天的囊胚期存在于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)ICM中。

PGC通過細(xì)胞遷移，長途跋涉，E10.5到達(dá)胚胎的生殖脊，在此過程中PGC數(shù)目逐漸增多，在生殖脊部位定植下來，隨后分化為生殖細(xì)胞：雄性胚胎中變成精原細(xì)胞，雌性胚胎中則形成卵原細(xì)胞。

生殖脊經(jīng)過分化、發(fā)育，最終形成雄性性腺睪丸和雌性性腺卵巢，而PGC最終變成了性腺部位的生殖細(xì)胞。

圖一：小鼠原始生殖細(xì)胞PGC（褐色細(xì)胞）在胚胎中的分布變化

原始生殖細(xì)胞在胚胎發(fā)育時期，從最初的外胚層（epiblast）經(jīng)過背系膜(dorsal mesentery)，最終到達(dá)生殖脊（genitarridge）引自Jae Yong Han:…genome editing in birds.”

2）出生后的生殖細(xì)胞

那么，胚胎在出生前夜，其精原細(xì)胞、卵原細(xì)胞會只是安靜待在自己的位置睡個大覺么？

卵原細(xì)胞不是的，她非常勤奮。雌性小鼠出生（E20）前夜，卵原細(xì)胞大量增殖，會進(jìn)行減數(shù)分裂，形成初級卵母細(xì)胞。小鼠在出生前形成生千個初級卵母細(xì)胞，而女性則達(dá)到了百萬數(shù)量級別，而這些卵母細(xì)胞只是停留在第一次減數(shù)分裂的雙線期，且大部分會在出生后發(fā)生程序化死亡。

出生后，睪丸和卵巢還會繼續(xù)發(fā)育。

在睪丸中精原細(xì)胞逐步分化，在性成熟時便開始進(jìn)行精子發(fā)生，通過減數(shù)分裂和有序分化，依次形成形成初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、圓形精子，最終圓形精子形成 “蝌蚪形”成熟的精子，形成生殖能力。

卵巢在性成熟時，卵母細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入到第二次減數(shù)分裂，形成了次級卵母細(xì)胞，最后通過排卵，進(jìn)入輸卵管，形成生殖能力。

與雌性小鼠卵巢發(fā)育過程類似，人類女性出生時卵巢中大約有200萬個卵泡（一個卵母細(xì)胞+N個顆粒細(xì)胞形成一個卵泡），到青春期時則只剩下約30萬個。數(shù)量貌似巨大，但是正常女性一生大概有約300-500個卵泡可以發(fā)育成熟并排卵。

圖二、哺乳動物卵巢結(jié)構(gòu)示意圖

卵巢中卵細(xì)胞與顆粒細(xì)胞組成卵泡結(jié)構(gòu)，在排卵周期中，首先原始卵泡（Primordial follicles）發(fā)育成初級卵泡（Primaryfollicles）、次級卵泡（Secondary follicles），在形成囊狀卵泡（Vesicularfollicle）后，卵細(xì)胞脫離卵泡結(jié)構(gòu)，排出卵巢，剩下的卵泡結(jié)構(gòu)逐漸萎縮形成黃體（Corpus luteum）（引自KevinCoward：Mammalian reproductive physiology）

在哺乳動物的生殖器官里，充滿了各種大同小異的細(xì)胞，那么如何從茫茫細(xì)胞海洋中得知哪些細(xì)胞是生殖干細(xì)胞干細(xì)胞，哪些細(xì)胞不是呢？

1）雄性生殖干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，出生時精原細(xì)胞數(shù)量是確定的。如果沒有一種生殖干細(xì)胞來提供精原細(xì)胞，導(dǎo)致精原細(xì)胞枯竭，那么男性產(chǎn)生精子的能力會迅速消失。

但事實卻不是這樣，剛才提到，男性一生中能產(chǎn)生超過5250億成熟精子，具有持續(xù)產(chǎn)生精子的能力。那么睪丸中必然存在著這么一種細(xì)胞，不斷補(bǔ)充精子產(chǎn)生所損耗的精原細(xì)胞。這種細(xì)胞符合干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，即必然存在著雄性生殖干細(xì)胞，一方面不斷分化補(bǔ)充精原細(xì)胞以供精子發(fā)生，一方面也不斷自我更新，維持自身數(shù)目，以避免干細(xì)胞資源枯竭。

我們知道，哺乳動物睪丸中彎曲盤旋著大量曲細(xì)精管，一個成年人所有曲細(xì)精管長度加起來可達(dá)260米。這些曲細(xì)精管負(fù)責(zé)精子的產(chǎn)生，成熟后的精子可以通過輸精管排出體外。

那么曲細(xì)精管的哪個位置，駐扎著干細(xì)胞呢？

小鼠性成熟時，睪丸曲細(xì)精管則為“中空”結(jié)構(gòu)，包含有處于各種分化時期的生殖細(xì)胞：如生殖干細(xì)胞、精原細(xì)胞、精母細(xì)胞等，在管中心附近聚集大量成熟精子，而雄性生殖干細(xì)胞則位于管壁附近（圖二和圖三）。

圖三、哺乳動物睪丸、曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)及精子形成過程示意圖

睪丸(testis)中存在著大量曲細(xì)精管（seminiferous tubule），在曲線精管管壁由外向管中心分別分布著支持細(xì)胞（sertoli cell）、精原細(xì)胞（germinal cell orspermatogonia cell）、初級精母細(xì)胞（primary spermatocyte）、次級精母細(xì)胞（secondary spermatocytes）、圓形精子(spermatids)和成熟精子(spermatozoa)

那么雄性生殖干細(xì)胞如何發(fā)現(xiàn)的呢？

最早在1994年美國人Brinster RL教授首次將小鼠精原細(xì)胞（包含有生殖干細(xì)胞）注射到無生精能力的小鼠睪丸曲細(xì)精管中，使小鼠恢復(fù)了生殖能力，首次通過試驗證明了小鼠雄性生殖干細(xì)胞的存在。隨后大量的研究工作，實現(xiàn)了體外分離培養(yǎng)雄性生殖干細(xì)胞，并找到了一些標(biāo)記物如PLZF，來識別體內(nèi)的雄性生殖干細(xì)胞。如下圖，就利用Stell4蛋白來標(biāo)記出了小鼠的雄性生殖干細(xì)胞（圖三，綠色細(xì)胞為生殖干細(xì)胞）。

圖四、新生小鼠雄性生殖干細(xì)胞定位：綠色細(xì)胞為Sall4+雄性生殖干細(xì)胞

藍(lán)色為細(xì)胞核，外圈紅色為支持細(xì)胞sertoli，顯示雄性生殖干細(xì)胞位于支持細(xì)胞所處的曲細(xì)精管外壁附近

人類睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)和干細(xì)胞定位模式與小鼠類似。但人類雄性生殖干細(xì)胞分離后在體外進(jìn)行長期培養(yǎng)直到2009才成功[4]。

所以，我們可以看出在成體雄性睪丸中，生殖干細(xì)胞位于曲細(xì)精管外壁附近，且數(shù)量稀少，但功能及其強(qiáng)大：如男性的生殖干細(xì)胞需要承擔(dān)起產(chǎn)生超過5250億成熟精子的任務(wù)。

2）雌性生殖干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)

傳統(tǒng)觀念依然認(rèn)為，雌性哺乳動物卵細(xì)胞數(shù)目在個體出生時，便已確定，不會更新增加，在性成熟后隨著不斷排卵，不斷減少，如正常女性一生中只能產(chǎn)生300-500顆成熟卵子。

這是否意味著，出生后的哺乳動物卵巢中無生殖干細(xì)胞存在，使得卵細(xì)胞最終走向枯竭，使得女性生育年齡受限在16-50歲。

圖：卵細(xì)胞的形成過程

而近期的研究結(jié)果正在挑戰(zhàn)這一傳統(tǒng)觀念，證明出生后卵巢中仍然存在著雌性生殖干細(xì)胞，支持著卵細(xì)胞更新。

最先發(fā)起這一挑戰(zhàn)的是Jonathan Tilly和吳際教授。

2004年，Jonathan Tilly教授在哈佛醫(yī)學(xué)院任職期間，發(fā)現(xiàn)了成年小鼠卵巢中存在著旺盛分裂的生殖細(xì)胞，且通過統(tǒng)計卵巢卵泡數(shù)目的變化，證明成年后卵細(xì)胞更新仍然存在[5]。這是科學(xué)界第一次拿出哺乳動物卵巢生殖干細(xì)胞存在的證據(jù)。

在2009年，Nature Cell Biology雜志發(fā)表上海交通大學(xué)吳際教授研究成果。通過磁珠分選技術(shù)，成功從小鼠卵巢中分離出雌性生殖干細(xì)胞，此干細(xì)胞能在體外穩(wěn)定培養(yǎng)并傳代，且通過移植實驗，將干細(xì)胞移植到無卵泡發(fā)生能力的小鼠卵巢后，使受體鼠生育能力恢復(fù)，證明了該細(xì)胞具有向卵細(xì)胞分化的能力[6]。

Jonathan Tilly和吳際教授的工作第一次將小鼠卵巢生殖干細(xì)胞進(jìn)行了定位：卵巢皮質(zhì)表面（圖五）。

圖五、雌性生殖干細(xì)胞定位圖

利用免疫組化（MVH信號）和免疫熒光（MVH綠色信號、BrdU紅色信號）將小鼠卵巢雌性生殖干細(xì)胞進(jìn)行定位，顯示其存在于皮質(zhì)區(qū)

在2012年，Jonathan Tilly教授則利用類似的流式分選技術(shù)，從人卵巢中分離得到了能進(jìn)行有絲分裂，且具有卵細(xì)胞分化能力的生殖干細(xì)胞。

其后，越來越多的研究者從大鼠、豬等哺乳動物中分離得到了雌性生殖干細(xì)胞，越來越多的證據(jù)支持哺乳動物雌性生殖干細(xì)胞的存在。

目前根據(jù)中國人口協(xié)會12年的《中國不孕不育現(xiàn)狀調(diào)研報告》，保守估計全國不孕不育的人數(shù)已經(jīng)高達(dá)4000萬，占育齡人口的12.5%，即每8對夫婦中就有1對有不孕不育問題，北上廣等一線城市甚至達(dá)到15%以上。

圖六、不孕不育年齡及性別比率統(tǒng)計 （引自《中國不孕不育現(xiàn)狀調(diào)研報告》）

那么，很多人就在想，通過雄性生殖干細(xì)胞的研究，是否能解決男性不育問題的方法？或者通過雌性生殖干細(xì)胞的研究，是否能找到延長女性生育時間、延緩女性卵巢衰老的好辦法？或者說找到解決女性不孕問題的方法？

筆者只能說，前景可期：生殖干細(xì)胞的研究，或許是解決這些問題的鑰匙之一。

1）產(chǎn)前篩查

如利用生殖干細(xì)胞鑒定與不孕不育相關(guān)的基因突變，為產(chǎn)前篩查提供參考。已有資料顯示，在男性不育方面，遺傳因素導(dǎo)致的不育占比為4%。單基因/多基因突變或者染色體畸變通過影響精原干細(xì)胞功能或者微環(huán)境（niche）變化，最終導(dǎo)致干細(xì)胞缺失或精子發(fā)生受阻[7]。

2）藥物開發(fā)

如利用生殖干細(xì)胞研究與生殖細(xì)胞分化、增殖的關(guān)鍵通路，為藥物設(shè)計提供靶點。利用靶標(biāo)藥物，對干細(xì)胞相關(guān)通路進(jìn)行抑制或者激活，加強(qiáng)人體生精的功能、排卵功能，治療弱精子癥、少精子癥等。

3）細(xì)胞儲存

或者提供生殖干細(xì)胞的儲存服務(wù)，為高危輻射環(huán)境工作人員、化療和放療患者等提供干細(xì)胞提取、擴(kuò)增和儲存方案，保護(hù)其生育能力。

總的來說，現(xiàn)實很殘酷，但未來可能很美好。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，相信生殖干細(xì)胞能更多地造福于人類。

希望早日實現(xiàn)From bench to beside。

參考文獻(xiàn)：

1 Sharma S, Wistuba J, Pock T, et al.Spermatogonial stem cells: updates from specification to clinical relevance[J].Human reproduction update, 2019.

2 Han J Y, Park Y H. Primordial germcell-mediated transgenesis and genome editing in birds[J]. Journal of animalscience and biotechnology, 2018, 9(1): 19.

3 NegusN C, Berger P J. Mammalian reproductive physiology[M]//Current mammalogy.Springer, Boston, MA, 1987: 149-173.

4 Sadri-ArdekaniH, Mizrak S C, van Daalen S K M, et al. Propagation of human spermatogonialstem cells in vitro[J]. Jama, 2009, 302(19): 2127-2134.

5 JohnsonJ, Canning J, Kaneko T, et al. Germline stem cells and follicular renewal inthe postnatal mammalian ovary[J]. Nature, 2004, 428(6979): 145.

6 Zou K,Yuan Z, Yang Z, et al. Production of offspring from a germline stem cell linederived from neonatal ovaries[J]. Nature cell biology, 2009, 11(5): 631.

7 SharmaS, Wistuba J, Pock T, et al. Spermatogonial stem cells: updates fromspecification to clinical relevance[J]. Human reproduction update, 2019.

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