該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)：在缺氧條件（危險(xiǎn)信號(hào)）下，MBD2的不同剪接體表達(dá)受到影響，即缺氧條件使得具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的、長(zhǎng)鏈剪接體MBD2a高表達(dá)，而具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的、短鏈剪接體MBD2c低表達(dá)（現(xiàn)象）。如圖1所示，缺氧條件下，活化的缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1通過抑制剪接因子SRSF2介導(dǎo)的選擇性剪接促進(jìn)MBD2a的產(chǎn)生，MBD2a與MBD2c競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合啟動(dòng)子CpG島，導(dǎo)致FZD1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的CpG（mCpG）島減少、非甲基化的CpG島增加，F(xiàn)ZD1的表達(dá)不再受抑制，從而促進(jìn)EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移機(jī)制）。臨床數(shù)據(jù)也顯示：MBD2兩種剪接體在調(diào)節(jié)人乳腺癌轉(zhuǎn)移方面的作用也是相反的（臨床數(shù)據(jù)支持）。

圖 1

其一，分子機(jī)制研究可以通過高通量如測(cè)序、質(zhì)譜、芯片等方法初步篩選，或者從文獻(xiàn)中尋找思路，如果能從目的基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能結(jié)構(gòu)域來闡釋實(shí)際的臨床現(xiàn)象，往往會(huì)更具說服力。文章所涉及的目的基因MBD2是甲基化的CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域（methyl-CpG binding domain，MBD）家族成員之一，是影響DNA甲基化的閱讀器（reader）。

MBD2包含在靶向腫瘤抑制基因、超甲基化啟動(dòng)子的核小體重構(gòu)和脫乙酰酶（nucleosome remodeling and deacetylase，NuRD）復(fù)合物中，以介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄沉默（圖2）²。從蛋白結(jié)構(gòu)分析，NuRD復(fù)合物包含6個(gè)核心亞基。其中兩個(gè)具有酶促功能亞基為：具有ATP依賴的染色質(zhì)重塑活性的Mi-2α和Mi-2β亞基；具有催化蛋白質(zhì)脫乙?；饔玫慕M蛋白脫乙?；窰DAC1、HDAC2。非酶亞基包括mCpG結(jié)構(gòu)域MBD2、MBD3，轉(zhuǎn)移相關(guān)亞基MTA1、MTA2和MTA3，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白R(shí)BBP4、RBBP7（也稱為RBAp46、RBAp48）以及GATAD2A、GATAD2B（也稱為p66α、p66β）。MBD長(zhǎng)鏈亞型MBD2a在N端有一個(gè)甘氨酸-精氨酸（GR）富集區(qū)域和MBD結(jié)構(gòu)域，C端有一個(gè)招募HDAC的轉(zhuǎn)錄抑制域（TRD），而短鏈亞型MBD2c擁有相同的MBD結(jié)構(gòu)域，但在C端有所不同（如圖1，MBD2結(jié)構(gòu)示意圖所示）。MBD2a與NuRD復(fù)合物相互作用，MBD2c缺少TRD結(jié)構(gòu)域而不具有上述與NuRD 復(fù)合物的相互作用³。

圖2  MBD2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制²

其二，已有文獻(xiàn)報(bào)道³雖然MBD2a和MBD2c均富集于OCT4和NANOG啟動(dòng)子，但是兩個(gè)剪接體在多能干細(xì)胞自我更新及纖維母細(xì)胞重編程過程中所起的作用不同：MBD2a通過與抑制性NuRD染色質(zhì)重塑因子相互作用促進(jìn)hPSC分化，而MBD2c促進(jìn)成纖維細(xì)胞重編程為多能性。這兩個(gè)剪接體在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的作用是怎樣的，有待進(jìn)一步探究。

其三，前期的乳腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在侵襲水平高的乳腺癌細(xì)胞系較中等侵襲水平的乳腺癌細(xì)胞系MBD2a高表達(dá)、而MBD2c低表達(dá)。

1. MBD2亞型結(jié)構(gòu)域功能已較為明確，結(jié)合已有研究得知：TRD是MBD2a唯一區(qū)別于MBD2c的結(jié)構(gòu)域（圖3），通過招募HDAC參與轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控；FZD1是Wnt/β-catenin通路和EMT的調(diào)節(jié)因子，在此作者只證明了MBD2a、MBD2c是否競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FZD1 mCpG區(qū)域。

圖3.MBD2的外顯子和MBD2蛋白亞型的結(jié)構(gòu)域³

通過在MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)Flag-MBD2a，同時(shí)在有或沒有GFP-MBD2c過表達(dá)的情況下，采用ChIP-seq的方法，用Flag抗體下拉，計(jì)算功能元件區(qū)域富集信號(hào)豐度；用相反的方式驗(yàn)證MBD2a是否影響MBD2c的豐度。熱圖（圖4 A）、富集輪廓圖（圖4 B）表明，MBD2a和MBD2c存在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。進(jìn)一步地，ChIP-seq發(fā)現(xiàn)與兩種剪接體都存在結(jié)合關(guān)系的基因3138個(gè)，RNA-seq找到調(diào)節(jié)兩個(gè)剪接體的共同基因1390個(gè)，取交集后得到174個(gè)基因（圖4 C）。說明二者有著許多相同的基因結(jié)合區(qū)域。

圖 4

為了明確FZD1具體的啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)域，采用IGV（Integrative Genomics Viewer）工具對(duì)FZD1基因組進(jìn)行可視化，IGV分析顯示MBD2c過表達(dá)顯著降低了FZD1基因高CpG密度區(qū)域上MBD2a的結(jié)合，同時(shí)MBD2a過表達(dá)也顯著降低FZD1基因高CpG密度區(qū)域上MBD2c的結(jié)合。并初步選擇3個(gè)潛在的作用位點(diǎn)，用ChIP-qPCR方法驗(yàn)證三位點(diǎn)的有效性（圖5 D、E）。

圖 5

2. 我們不妨去思考下，當(dāng)上述乳腺癌轉(zhuǎn)移的蛋白亞型功能結(jié)構(gòu)域并不明確時(shí)，如何證明？常規(guī)思路是采用基因工程的方法構(gòu)建突變體蛋白/截短蛋白，結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)確定功能性結(jié)構(gòu)域。如下圖6，另一篇文章中，通過基因插入、插入/刪除終止子、基因敲除的方法構(gòu)建基因突變體，細(xì)胞轉(zhuǎn)染或感染后檢測(cè)細(xì)胞某種功能，以此判斷蛋白亞型的功能性結(jié)構(gòu)域⁴。

圖 6

前面介紹了MBD2是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子。但是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻表明MBD2a在轉(zhuǎn)錄水平上正調(diào)控FZD1，該如何理解呢？已有報(bào)道證明MBD2a作為DNA去甲基酶，通過去除抑制性甲基殘基而上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子uPA和Foxp3的表達(dá)，從而引起啟動(dòng)子特異性基因轉(zhuǎn)錄激活。此外，據(jù)推測(cè)MBD2募集了激活因子來啟動(dòng)基因表達(dá)。MBD2與CEBPA、MBDin、TACC3、FAK / PYK2、NGFI684 A等蛋白形成復(fù)合物，在多數(shù)情況下，上述激活因子與含HDAC的復(fù)合物互斥，因此即使在最終去甲基之前也可解除MBD2的抑制作用。目前，MBD2a直接去甲基化還是通過募集去甲基化酶促進(jìn)FZD1的表達(dá)還不明確。

作者通過BSP克隆測(cè)序法或甲基化特異性PCR（MSP）檢測(cè)到MBD2a敲減或MBD2c過表達(dá)時(shí)，F(xiàn)ZD1的甲基化水平增加。而在培養(yǎng)基中加入DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑DAC后，F(xiàn)ZD1的甲基化水平升高被逆轉(zhuǎn)，這導(dǎo)致FZD1 mRNA水平升高。因此，當(dāng)MBD2剪接變體的表達(dá)變化時(shí)，F(xiàn)ZD1啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)改變可能是導(dǎo)致FZD1 mRNA表達(dá)變化的原因。

與MBD2a相比，關(guān)于MBD2c在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用或MBD2c如何調(diào)節(jié)基因表達(dá)作用的研究相對(duì)較少。通過該研究發(fā)現(xiàn)：1）MBD2c是轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移性乳腺癌潛在的分子標(biāo)記物；2）提出MBD2c與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的新見解并初步闡明機(jī)制。

但不足的是，該研究并未闡釋MBD2c在乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的詳細(xì)機(jī)理信息，例如MBD2a/c對(duì)mCpG的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合、FZD1甲基化、FZD1表達(dá)、FZD1介導(dǎo)的β-catenin、Snail1表達(dá)等發(fā)生的先后順序。有待采用晶體結(jié)構(gòu)分析和其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明，對(duì)于臨床干預(yù)具有重要的參考價(jià)值。

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