一.研究背景

乳腺癌（BRCA）根據(jù)不同的分子特征分為不同的亞型。激素受體狀態(tài)是BRCA最重要的特征之一，約70%的BRCA患者是ER（雌激素受體）陽性。

ER陽性的BRCA也包括兩大亞型，即管腔A型和管腔B型，管腔B型腫瘤的預(yù)后較管腔A亞型差。據(jù)研究表明，表觀遺傳修飾，尤其是DNA甲基化，在BRCA進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，并與BRCA異質(zhì)性密切相關(guān)。

二.分析流程

三.結(jié)果解讀

1.TCGA-BRCA的一致性聚類和亞群的甲基化水平

作者收集了TCGA數(shù)據(jù)庫中785個(gè)BRCA和98個(gè)正常乳腺組織樣本，分析和篩選了甲基化數(shù)據(jù)(共485,577個(gè)CpG位點(diǎn))。在883個(gè)樣本中去除了甲基化β值丟失的CpG位點(diǎn)，有363,870個(gè)CpG位點(diǎn)保留。然后作者設(shè)定一個(gè)腫瘤甲基化的閾值，并提取18,870個(gè)CpG位點(diǎn)用于后續(xù)分析。

• 使用R包‘consusclustERplus’ 作了一致性聚類：

• 將聚類閾值設(shè)為K=6時(shí)，確定了兩個(gè)主要的亞群，它們包含了所有癌癥樣本的90.0%，其中415個(gè)樣本位于亞群1；292個(gè)樣本位于亞群2(圖1a)。

• 然后利用嚴(yán)格的閾值K=20，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)亞群中的大多數(shù)樣本保持穩(wěn)定，分別在亞群1和亞群2中保留了337(81.2%，337/415)和259(88.7%，259/292)樣本(圖1b)。

• 此外，還計(jì)算了亞群1、亞群2和正常樣本中CpG位點(diǎn)的平均甲基化水平：與正常樣本相比，亞群1的甲基化水平最高，亞群2的甲基化水平中等(圖1c)。

• 熱圖還顯示，在TGCA-BRCA亞群1、2之間存在明顯不同的甲基化特征(圖1d)。
  

2.低甲基化ER陽性TCGA-BRCA亞群具有良好的OS

• 作者在亞群1、2的TCGA-BRCA樣本中研究了組織類型。結(jié)果表明，這兩個(gè)簇具有相似的組織學(xué)組成比（例如浸潤性導(dǎo)管癌和浸潤性小葉癌)(圖2a)；

• 此外，還進(jìn)行了生存分析，以探索在亞群1和2中TCGA-BRCA的總體生存概率，兩組患者的生存期無顯著差異(p= 0.30)(圖2b)；

• 由于激素受體狀態(tài)，特別是ER與腫瘤進(jìn)展和甲基化修飾密切相管，作者，探討了ER在亞群1和亞群2中的狀態(tài)。結(jié)果顯示，大部分亞群1樣品為ER陽性BRCA；而亞群2則較復(fù)雜：其中43.2%(112/259)的ER陽性BRCA, 52.1%(135/ 259)的ER陰性BRCA(圖2c）；

• 根據(jù)激素受體狀態(tài)和甲基化概況，作者將腫瘤分為三個(gè)亞組：高甲基化ER陽性、低甲基化ER陽性和低甲基化ER陰性BRCA，作了生存分析：發(fā)現(xiàn)低甲基化陽性組的生存期優(yōu)于高甲基化ER陽性和低甲基化ER陰性組（圖2d）。   
  

3.低甲基化ER陽性具有良好OS的發(fā)現(xiàn)在另一個(gè)獨(dú)立群體中得到驗(yàn)證

作者收集并分析了另一個(gè)包含30個(gè)ER陽性樣本的甲基化數(shù)據(jù)集，同樣，一致性聚類分析仍將腫瘤樣本分為了兩大聚類(圖3a)，并通過熱圖進(jìn)行了證實(shí)(圖3b)。進(jìn)一步的分析表明，低甲基化的ER陽性BRCA亞群確實(shí)具有較好的OS(圖3c, d)。

4.在低甲基化ER陽性和高甲基化ER陽性TCGA-BRCA亞型之間存在大量甲基化差異的CpG位點(diǎn)

由于ER陽性的TCGA-BRCA有兩個(gè)甲基化亞群，在OS上存在顯著差異，作者重點(diǎn)關(guān)注了那些有助于ER陽性BRCA分類的CpG位點(diǎn)。

• 在高甲基化ER陽性和低甲基化ER陽性兩個(gè)亞群中確定了3032個(gè)DMCs（差異甲基化CpG位點(diǎn)）。在這些DMCs中，低甲基化ER陽性亞組中約有91.4%(2772/3032)的圖4a)。

• 然后作者把上述這2772個(gè)低甲基DMCs按甲基化平均得分分為兩個(gè)亞組。通過生存分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，低甲基化水平的ER陽性腫瘤樣本具有良好的OS(圖4b）。

• 又作了基因注釋分析，低甲基化DMCs主要位于“Body”、“TSS200”等基因組序列中。

• 還作了GSEA，結(jié)果顯示:與DMCs相關(guān)的1190個(gè)基因在Wnt (hsa04310)、Hippo (has04309)、Rap1 (hsa04015)、基底細(xì)胞癌(hsa05217)、乳腺癌(hsa05202))等通路中顯著富集(圖4d)。這表明這些低甲基化DMCs在抑制ER陽性BRCA進(jìn)展中的潛在作用。
  

5.ER陽性BRCA亞群中關(guān)鍵的低甲基化DMCs對腫瘤有抑制作用

• 為了檢測這些低甲基化DMCs是否有可能具有促進(jìn)腫瘤抑制作用的基因轉(zhuǎn)錄的作用，作者共鑒定了178個(gè)基因，基因的表達(dá)與低甲基化DMCs的低甲基化與基因表達(dá)水平升高有關(guān)(圖5a)。

• 進(jìn)一步的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析表明，蛋白之間的相互作用明顯多于預(yù)期。(圖5b)。
  

6.ER陽性BRCA的低甲基化促進(jìn)腫瘤抑制基因的表達(dá)

• 作者繼續(xù)在ER陽性TGCA-BRCA中鑒定出47(47/178)個(gè)高表達(dá)、OS好的基因(圖6a）。

• 作KEGG通路分析：這47個(gè)基因在Wnt信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路、以及癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等通路中均有富集（圖6b）。

• 作者從其他基因相關(guān)功能的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)部分低甲基化DMCs通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄來抑制腫瘤。

• 比如cg24319902是位于SFRP1 TSS200區(qū)域的CpG位點(diǎn)，與高甲基化ER陽性的TGCA-BRCA相比，低甲基化陽性的TGCA-BRCA CpG位點(diǎn)的甲基化水平降低(圖6c)。且cg24319902甲基化與SFRP1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(圖6d）。在TCGA-BRCA中，較高的SFRP1表達(dá)水平具有更好的OS(圖6e)。

• 此外，另一個(gè)CpG位點(diǎn)，cg21383810在低甲基化ER陽性的TGCA-BRCA亞群中也呈現(xiàn)低甲基化(圖6f)。該CpG位點(diǎn)位于WTF1的TSS1500區(qū)域，同樣與WIFI的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖6g）。較高的WTF1表達(dá)水平具有更好的OS(圖6h）。