特應(yīng)性皮炎（Atopic dermatitis；AD）是一種常見的皮膚疾病，以劇烈瘙癢和濕疹樣皮損為主要特征。全球兒童患病率為 15%至20%，成人為1%至3 %。研究發(fā)現(xiàn)大量金黃色葡萄球菌定植于AD患者皮膚表面，并通過促進炎癥加劇疾病進程。正常人類皮膚表面微生物群落相互依存又相互制約可維持皮膚、黏膜表面的菌群平衡。一些與皮膚共生、血漿凝固酶陰性菌株（CoNS）產(chǎn)生的細菌素可以選擇性地抑制皮膚表面上的非常駐致病菌，如金黃色葡萄球菌、A 組鏈球菌和大腸桿菌的生長繁殖。

本研究中作者從健康受試者的皮膚中篩選出一種CoNS菌株—人葡萄球菌A9 （ShA9），發(fā)現(xiàn)ShA9有效殺滅小鼠皮膚上的金黃色葡萄球菌，并抑制了金黃色葡萄球菌中促進炎癥的毒素（psmα）的表達。本研究一方面采用臨床前AD小鼠實驗?zāi)Ｐ蛠碓u估ShA9潛在的治療作用及其機制，并進行了隨機雙盲對照的臨床試驗進一步考察其對AD患者的安全性及有效性。

從健康受試者的皮膚中篩選出8000多株CoNS細菌，并從中篩選出能夠抑制金黃色葡萄球菌生長的菌株，然后進一步評估了這些菌株的其他特性，比如恢復(fù)受損皮膚屏障的能力，對常見的抗生素敏感，對金黃色葡萄球菌抑制的選擇性等。基于這些標(biāo)準(zhǔn)，作者最終選擇人型鏈球菌 （ShA9） 菌株用于 AD小鼠模型的臨床前研究。

通過一天兩次涂抹卵清蛋白（OVA）溶液致敏并與金黃色葡萄球菌定植3天建立AD小鼠模型，然后在背部涂抹ShA9 菌株3天，觀察其療效。如圖1所示：

1.  ShA9能夠抑制金黃色葡萄球菌的存活，并有效改善皮膚表面局部紅斑現(xiàn)象（圖1a）

2.  皮損評分（g）和經(jīng)皮失水率TEWL（h）也顯著性降低（圖1b）

3.  ShA9能夠抑制AD炎癥反應(yīng)，有效降低IL-4、IL-13、TSLP、IL-17、IL-22等與AD密切相關(guān)的炎癥因子的水平（圖1c）

此外，由于TH2細胞因子如IL-4和IL-13的抑制作用，AD患者某些宿主防御肽的相對表達水平較低，應(yīng)用ShA9可增加抗菌肽Camp（圖1d）, mDB14（圖1e） 和 mBD4（圖1f）的mRNA的表達。表明ShA9除了具有直接抗菌作用外，還能增強宿主的抗菌防御系統(tǒng)。

已有文獻發(fā)現(xiàn)，ShA9可產(chǎn)生兩種對金黃色葡萄球菌具有抑制作用的活性的羊毛硫抗生素（隸屬于抗菌肽）。為了研究在局部應(yīng)用ShA9后觀察到的抗炎活性是否依賴于殺死金黃色葡萄球菌，通過等位基因交換刪除了ShA9中的兩個羊毛硫抗生素基因。如圖2所示，

1.  與野生型（WT）ShA9 相比，突變型ShA9菌株（ShA9-Δlanti）在瓊脂上的生長良好，表明野生型的ShA9能殺死金黃色葡萄球菌，而突變型ShA9菌株卻不能（圖2a）

2.  突變型ShA9 菌株（ShA9-Δlanti）與ShA9的WT親本菌株的效果比較顯示，ShA9-Δlanti 抑制金黃色葡萄球菌在小鼠皮膚上繁殖的能力大大降低（圖2a）

突變體ShA9 菌株不能有效殺死金黃色葡萄球菌，但保留了其抑制炎癥反應(yīng)的能力，IL-4（圖2c）、IL-13（圖2d）、IL-17（圖2e）的mRNA表達水平都降低，恢復(fù)了 Camp 的表達（圖2f）,并且能夠抑制Th2和Th17細胞的浸潤（圖2g-i）。另外，作者發(fā)現(xiàn)突變ShA9-Δlanti 菌株與野生菌株在抑制酚溶調(diào)控蛋白-α (PSMα) 的mRNA 表達方面作用相當(dāng)（圖2j），PSMα是一種受群體感應(yīng)控制并促進皮膚炎癥的金黃色葡萄球菌毒素。圖2的結(jié)果表明，突變型ShA9-Δlanti菌株盡管不抑制金黃色葡萄球菌的生長，但仍能抑制炎癥反應(yīng)，保留了其抑制群體感應(yīng)的能力。

基于以上觀察結(jié)果，作者提出ShA9 可以通過三種機制發(fā)揮緩解AD作用（圖3a）：

1.  直接殺死金黃色葡萄球菌

2.  抑制群體感應(yīng)（群體感應(yīng)是細菌根據(jù)細胞密度進行基因調(diào)控的一種生理行為，能夠改變細菌的毒力基因的表達等）

3.  促進其他共生體的保護功能

圖3b是對金黃色葡萄球菌定植的 AD 成人患者局部應(yīng)用ShA9的臨床研究方案設(shè)計。

作者以人體安全性作為主要終點，設(shè)計了一項1期隨機、雙盲、對照的臨床試驗，納入54名成人中重度AD患者，皮膚金黃色葡萄球菌感染陽性，其中36人接受ShA9治療，18人作為對照。在7個時間點取皮膚拭子：分別是第1天第一次涂抹之前和之后的1h，在給藥的第4天和第7天，第7天最后一次給藥后的24、48和96h。

表1顯示了AD 成人患者局部應(yīng)用ShA9在8天內(nèi)不良反應(yīng)發(fā)生率。ShA9治療組的總不良反應(yīng)發(fā)生率是55.6%，安慰劑對照組不良反應(yīng)發(fā)生率達到83.3% (P = 0.044)。

表2顯示的是主要的不良反應(yīng)評判事件有eczema（濕疹）、pruritus（瘙癢）、pain in extremity（四肢疼痛）、peripheral swelling（腫脹）、abdominal pain upper（上腹痛）、abdominal discomfort（腹部不適）、furuncle（癤子，金葡菌引起的化膿性感染）、dysmenorrhea（痛經(jīng)）等。

圖3c-j表明，局部應(yīng)用ShA9可減少AD患者金黃色葡萄球菌的定殖，AD患者局部炎癥的改善與ShA9殺滅金黃色葡萄球菌相關(guān)。

（圖3c）皮損區(qū)和非皮損區(qū)7個時間點皮膚表面葡萄球菌的數(shù)量。ShA9 減少了AD患者病變和非病變皮膚上金黃色葡萄球菌菌落形成單位。

由于ShA9的抗菌活性對某些金黃色葡萄球菌菌株具有選擇性，包括對AD26的臨床分離株的選擇性，因此作者還測量了從每位參與者基線拭子中回收的金黃色葡萄球菌的分離株對體外ShA9的敏感性。大多數(shù)個體都被對ShA9抑制生長敏感的金黃色葡萄球菌菌株定殖。在第7天和隨訪階段，參與者對皮膚殺死的敏感性與參與者皮膚上金黃色葡萄球菌豐度的變化有關(guān)。通過相關(guān)性分析，分析了皮膚表面的金黃色葡萄球菌豐度與ShA9的敏感性之間的關(guān)系（圖3d） 。

接下來作者從AD患者身上回收了沒有被ShA9殺死的金黃色葡萄球菌，多肽耐藥因子（mprF）是一種由金黃色葡萄球菌表達的基因，之前已報道該基因抑制抗菌肽（AMP）的表達。與野生型金黃色葡萄球菌相比，敲除mprF的金黃色葡萄球菌組（ΔmprF）對ShA9敏感性更強（圖3e）。

而從AD患者中分離出的金黃色葡萄球菌中mprF的表達量更高，則對ShA9的抗菌活性更具耐藥性（圖3f）。

對ShA9敏感或耐藥的金黃色葡萄球菌定植的AD患者皮損表面金黃色葡萄球菌mprF mRNA的豐度（圖3g）。對ShA9耐藥的金黃色葡萄球菌定植的AD患者損傷皮膚中mprF的mRNA表達量更高。這些數(shù)據(jù)表明，金黃色葡萄球菌的 mprF表達會影響 ShA9 直接抑制金黃色葡萄球菌存活的能力。

相關(guān)性分析圖展示的是ShA9抑制敏感的金黃色葡萄球菌生長的能力和濕疹改善評分之間的關(guān)系（圖3h），可以看到ShA9的殺菌能力越強，患者濕疹改善越好。

圖3i和圖3j是做的7個時間點的EASI和SOORAD評分變化曲線，可以看到對ShA9敏感的AD患者，濕疹評分顯著降低的，并且這種作用持續(xù)到了末次給藥后的96h。這些觀察結(jié)果支持金黃色葡萄球菌在AD 發(fā)病機制中的作用，并表明局部應(yīng)用合理的人類共生菌可以使部分AD 患者受益。

接下來作者研究了ShA9改善AD第二個機制——ShA9對群體感應(yīng)的作用（圖4）。首先是評估了ShA9在皮膚上的持久性，通過測量總CoNS 的菌落計數(shù)作為 ShA9豐度的替代測量。

在圖4a中，作者分別檢測了皮損和非皮損部位的有益菌CoNS的豐度?？梢钥吹皆诘谝淮螒?yīng)用ShA9 后1小時，損傷和非損傷皮膚均顯示皮膚上的活CoNS 增加3到4個對數(shù)，對照組沒有變化。接受 ShA9 治療的參與者在第4天和第7天非病變皮膚上 CoNS 數(shù)量更多。有趣的是，即使在最后一次應(yīng)用后 96 h，在非病變皮膚上仍檢測到更高水平的CoNS菌株。

圖4b記錄了病變皮膚中AIP（自誘導(dǎo)肽）mRNA的表達 。為了評估ShA9的轉(zhuǎn)錄活性，可以看到AIP（自誘導(dǎo)肽）和抗菌肽這兩個基因的mRNA水平都明顯升高，在治療后96h也維持在較高的水平。雖然局部應(yīng)用ShA9 1h后皮損區(qū)有益菌的豐度就開始降低了，但是ShA9代謝產(chǎn)物在病變區(qū)和非病變區(qū)都能維持在較高水平。

金黃色葡萄球菌的重要毒力因子psmα（圖4c），它是群體感應(yīng)下游的一個毒素，它的表達和AIP的表達是呈負相關(guān)的，經(jīng)過治療之后psmα的表達下降。

圖4d是評價了psmα和EASI評分之間的相關(guān)性，可以看到在ShA9治療組中，局部EASI評分的改善與金黃色葡萄球菌psmα表達降低有關(guān)。

接下來作者建立了小鼠AD模型來驗證ShA9對psmα的抑制作用是否與殺死金黃色葡萄球菌有關(guān)（圖4e），小鼠分別用高表達和低表達psmα的金黃色葡萄球菌來定植，采用ShA9局部治療后，ShA9并沒有殺死高表達psmα的金黃色葡萄球菌，但是卻大大減少了低表達psmα金黃色葡萄球菌的定植。

圖4f-i展現(xiàn)的是病變背部皮膚中psmα（圖4f）、IL-4（圖4g）以及Camp（圖4i）mRNA的表達水平，以及在每組（i）中觀察到的皮膚炎癥請情況。不管金黃色葡萄球菌是高表達psmα還是低表達psmα，ShA9都能降低psmα和IL-4的表達水平，同時恢復(fù)Camp的表達。也改善了由金黃色葡萄球菌定植導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。

這些數(shù)據(jù)表明這些數(shù)據(jù)表明，ShA9 的應(yīng)用通過抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)對抗金黃色葡萄球菌定植，并且這種保護作用與ShA9這可以獨立于ShA9羊毛硫抗生素直接殺死金黃色葡萄球菌。

最后作者探究了ShA9促進其他皮膚共生群的影響（圖5）。為了研究 ShA9 對 AD 病變皮膚整體細菌群落的影響，作者對16S核糖體RNA基因的 V1-V9 進行了全長測序。

細菌組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在ShA9治療組中（圖5a），金黃色葡萄球菌的序列讀取頻率大大降低（黃色），并擴大了人型葡萄球菌的比例（綠色）。

主成分分析（圖5b）表明，與對照組比較，ShA9組在治療后96h的微生物組成發(fā)生了明顯改變。

減去人型葡萄球菌后，顯示了局部應(yīng)用ShA9組或?qū)φ战M皮膚細菌種類的相對比例（圖5c-d）。ShA9治療增加了表皮葡萄球菌的比例（藍色的），對照組中并沒有出現(xiàn)。

圖5e和圖5f是金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所占的比例，表皮葡萄球菌增加的比例要高于金黃色葡萄球菌降低的比例。

皮膚菌群的結(jié)果表明局部應(yīng)用ShA9 可能促進其他CoNS物種（有益菌）在AD病變皮膚上的重新定植。

作者在結(jié)論部分提出采用共生微生物治療AD的新方法在1期隨機臨床試驗中顯示是安全且有效的, 有效避免了類固醇和其它靶向作用宿主機體免疫系統(tǒng)的藥物所產(chǎn)生的副作用。并且局部應(yīng)用 ShA9 后，耐藥的金黃色葡萄球菌也未被檢測到。當(dāng)然也需要進一步研究以評估這種方法對AD患者進行細菌治療的長期風(fēng)險和益處。

采用細菌療法治療疾病并不是特別新奇的點，癌癥、結(jié)腸炎等疾病中均有相關(guān)的報道。而采用通過篩選皮膚表面的有益共生微生物來治療皮膚疾病，創(chuàng)新點強。并且，作者在前期動物實驗上進行了深入的機制探討，1期臨床試驗上也進行了安全性和有效性的初步驗證，有較強的實際應(yīng)用價值，想必這也是它能被nature子刊接收的重要原因！這篇論文的確是高分臨床文章的代表性佳作。

參考文獻：Nakatsuji T, Hata TR, Tong Y, et al. Development of a human skin commensal microbe for bacteriotherapy of atopic dermatitis and use in a phase 1 randomized clinical trial. Nat Med. 2021, 27:700-709.

國慶節(jié)的祝福，就不給你整虛的！

做科研5年了，會做多少實驗，發(fā)表多少篇SCI才算正常水平？

剛剛公布！國自然基金委重要通知！