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T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) T細(xì)胞工程始于使用 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，后來擴(kuò)展到慢病毒載體和 DNA 轉(zhuǎn)座子，所有這些都介導(dǎo)了穩(wěn)定的長(zhǎng)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)。信使RNA轉(zhuǎn)染也可用于瞬時(shí)CAR表達(dá)的目的。大多數(shù)γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來源于莫洛尼鼠白血病病毒和骨髓增殖性肉瘤病毒，并經(jīng)過優(yōu)化以促進(jìn)高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。 FDA 批準(zhǔn)的五種 CAR T細(xì)胞產(chǎn)品中的三種，Breyanzi、Tecartus 和 Yescarta，利用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將 CD19 特異性 CAR 遞送到 T 細(xì)胞中。大多數(shù)慢病毒載體源自HIV-1，并使用VSV-G 包膜進(jìn)行假型化。γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體均介導(dǎo)高水平和穩(wěn)定的CAR表達(dá)。 迄今為止，融合性 VSV-G 糖蛋白的組成型表達(dá)阻礙了穩(wěn)定包裝細(xì)胞系的建立，這是載體生產(chǎn)的重大負(fù)擔(dān)，但慢病毒載體是有效的。Kymriah 是 FDA 和 EMA 批準(zhǔn)的第一個(gè)4-1BB CAR，是一種T細(xì)胞產(chǎn)品，由瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的載體制造。 基于 DNA 轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)，如睡美人，已被開發(fā)用于生產(chǎn)用于臨床研究的 CAR T細(xì)胞，并最初顯示出適度的功效 。與病毒載體相比，睡美人的局限性包括遺傳轉(zhuǎn)座效率低，因此，需要通過人工APC 和細(xì)胞因子刺激來繁殖CAR T細(xì)胞，從而導(dǎo)致體外培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)。 最近，使用靶向核酸酶結(jié)合腺相關(guān)病毒載體作為CAR轉(zhuǎn)錄單位的供體 DNA進(jìn)行位點(diǎn)特異性CAR整合，已經(jīng)能夠從 T 細(xì)胞受體 α 鏈 (TRAC) 位點(diǎn)嚴(yán)格調(diào)節(jié) CAR 表達(dá)。 由基因編輯工具（例如 CRISPR/cas9 和引導(dǎo) RNA）啟用的位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂隨后通過同源定向修復(fù)進(jìn)行修復(fù)。 自體CAR-T細(xì)胞 自體CAR T細(xì)胞制造始于收集患者或捐贈(zèng)者的血液或白細(xì)胞去除術(shù)。CD3 T細(xì)胞用作 CAR T 細(xì)胞制造的起始細(xì)胞。腫瘤 細(xì)胞和單核細(xì)胞的去除可以通過CD4 和 CD8 T細(xì)胞的陽性選擇來介導(dǎo)。CD4/CD8 T 細(xì)胞選擇已被證明可以提高CAR T細(xì)胞制造的可行性，并導(dǎo)致與全單采產(chǎn)品相比，炎癥毒性更高，導(dǎo)致患者 I 期臨床試驗(yàn)中的劑量降低復(fù)發(fā)/難治性CD22 惡性腫瘤。從具有確定特性的 T 細(xì)胞群中生成 CAR T 細(xì)胞有可能為從一個(gè)患者到另一個(gè)患者提供更一致的材料來源。 在動(dòng)物模型中已經(jīng)表明，與源自TN na?ve 、TCM 中央記憶 或 TSCM 記憶干細(xì)胞亞群的 CAR T 細(xì)胞相比，CAR T 細(xì)胞具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性。大量 T 細(xì)胞， CD8 TCM 亞群也已被證明在臨床前模型中是活躍的。 源自 CD62L TCM 亞群的 CAR T 細(xì)胞已用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的臨床環(huán)境，并促進(jìn)了一名患者的腫瘤消退。 具有確定比例的 CD4 CAR 和 CD8 CAR TCM，或 CD4 CAR 和 CD8 CAR 的 CAR T 細(xì)胞可能會(huì)減輕毒性，并促進(jìn) B-ALL 和 NHL 患者在輸注后的無病生存。 T 細(xì)胞亞群可能的治療益處需要在長(zhǎng)期患者隨訪和更大的患者隊(duì)列中進(jìn)行評(píng)估，以確定其益處是否證明制造方案的復(fù)雜性增加以及與選擇程序相關(guān)的額外成本是合理的。 T細(xì)胞的活化 用 OKT3 抗體激活 T 細(xì)胞可以用 CD28 等共刺激分子進(jìn)行調(diào)節(jié)。已開發(fā)出與抗 CD3 和抗 CD28 抗體偶聯(lián)的現(xiàn)成的當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范 (cGMP) 珠子，以優(yōu)化 T 細(xì)胞選擇和體外擴(kuò)增（磁性 DynabeadsTM [116]、T-cell TransActTM 生物可降解納米珠），并廣泛用于在臨床 CAR T 細(xì)胞制造的背景下激活T細(xì)胞。 或者，人工抗原呈遞細(xì)胞 (AAPC)，如 K562 CML 細(xì)胞，已被定制并用共刺激分子裝飾，以激活和擴(kuò)展 T 細(xì)胞亞群，如CD8 、抗原特異性和 CD19-CAR-T 細(xì)胞。單獨(dú)或與愛潑斯坦-巴爾病毒 (EBV) 特異性 LCL結(jié)合 OKT3 抗體和 IL2 的輻照自體 PBMC也已分別用于生成 CD19 和 CD20特異性CAR T細(xì)胞。盡管如此，由于根據(jù) cGMP 生成 AAPC 的復(fù)雜性，AAPC 作為 T 細(xì)胞激活劑的臨床應(yīng)用數(shù)量相當(dāng)有限。 T細(xì)胞擴(kuò)增 有幾個(gè)平臺(tái)，例如燒瓶和袋子中的靜態(tài)培養(yǎng)、波動(dòng)混合生物反應(yīng)器和連續(xù)生物反應(yīng)器中的擴(kuò)增，可用于制造臨床 CAR T 細(xì)胞（Wang 和 Riviere 綜述）。波浪混合生物反應(yīng)器被學(xué)術(shù)中心和生物技術(shù)公司廣泛用于 CAR T 細(xì)胞擴(kuò)增，以支持早期臨床試驗(yàn)。 其他集成制造平臺(tái)，例如 CliniMACS Prodigy System，是完全封閉的，旨在整合 T 細(xì)胞選擇、激活、轉(zhuǎn)導(dǎo)、擴(kuò)增和配方，從而實(shí)現(xiàn)更高程度的自動(dòng)化，支持連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)，并在很大程度上減少人際操作員的變異性.使用 CliniMACS Prodigy 制造的 CD19 CAR T 細(xì)胞進(jìn)行的 I 期臨床試驗(yàn)產(chǎn)生了令人鼓舞的臨床反應(yīng)，有可能實(shí)現(xiàn)即時(shí)制造的概念 。 另一種新推出的集成端到端電池制造解決方案是Cocoon平臺(tái)，目前正在以色列 Sheba 醫(yī)療中心的臨床試驗(yàn)中對(duì)其進(jìn)行研究 (NCT02772198)。 提高自體患者來源 T 細(xì)胞的抗腫瘤功效的需要促使開發(fā)新的培養(yǎng)試劑、技術(shù)和制造平臺(tái)。特別是，在動(dòng)物模型和人類受試者中，培養(yǎng)時(shí)間少于24小時(shí)的最低限度操作的CAR T細(xì)胞已證明具有一定水平的抗腫瘤活性。這種方法的優(yōu)化可以簡(jiǎn)化CAR-T制造，并有可能大幅降低總成本。 同種異體CAR-T細(xì)胞 雖然自體CAR T細(xì)胞療法需要針對(duì)每位患者的白細(xì)胞去除術(shù)進(jìn)行定制的制造工藝，但現(xiàn)成的和同種異體CAR療法提供了避免患者 T 細(xì)胞的可變質(zhì)量和損傷的前景，減少了產(chǎn)量的可變性并使表型均勻化注入的CAR T細(xì)胞。一旦開出CAR T細(xì)胞，同種異體CAR T細(xì)胞也將縮短 T 細(xì)胞輸注的延遲。 然而，同種異體方法面臨兩個(gè)主要挑戰(zhàn)。第一個(gè)是引起移植物抗宿主病 (GVHD) 的風(fēng)險(xiǎn)，第二個(gè)是宿主免疫系統(tǒng)快速消除同種異體細(xì)胞，限制了它們的抗腫瘤活性。有幾種解決方案可以解決第一個(gè)挑戰(zhàn)，使用來自干細(xì)胞移植供體的同種異體CAR T細(xì)胞、病毒特異性記憶 T 細(xì)胞、非 αβ T細(xì)胞和/或基因編輯來消除TCR表達(dá)。第二個(gè)挑戰(zhàn)，避免快速消除，更復(fù)雜，仍在等待有效的解決方案。 IPS-T 從誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC) 產(chǎn)生免疫細(xì)胞提供了一個(gè)替代平臺(tái)來生產(chǎn)“現(xiàn)成的”和合成的同種異體 T 細(xì)胞。原理驗(yàn)證研究支持這種方法的可行性。iPS 衍生的NK細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入臨床 (NCT03841110)，iPS衍生的T細(xì)胞將很快在復(fù)發(fā)/難治性 B 細(xì)胞淋巴瘤患者中進(jìn)行研究 (NCT04629729)。 體內(nèi)CAR-T的生成 CAR T細(xì)胞有可能在體內(nèi)進(jìn)行改造，完全通過體外制造。這項(xiàng)技術(shù)處于發(fā)展的早期階段，其潛力仍然未知。使用 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體和脂質(zhì)納米顆粒的早期研究表明在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo) T 細(xì)胞的可行性。 昨天和今天的文獻(xiàn)均來自文獻(xiàn)Eur.J.Immunol.2021.51:2151–2163 DOI:10.1002/eji.202049064 |
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