2021年9月18日/醫(yī)麥客新聞 eMedClub News/--2021年9月10日，醫(yī)麥客攜手丹納赫生命科學開展了系列沙龍中的首場活動，主題為《病毒類遞送載體AAV的研發(fā)與工藝技術(shù)》。

近年來，全球共兩款AAV基因療法獲批上市，包括治療眼部疾病的Luxturna和靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Zolgensma。國內(nèi)在2021年上半年也接連批準了紐福斯的NR082和信致醫(yī)藥的BBM-H901注射液這兩款AAV體內(nèi)基因治療藥物進入臨床，進一步推動AAV成為業(yè)界關(guān)注的焦點。

AAV基因治療作為目前最熱門的細分賽道，國內(nèi)有越來越多的生物技術(shù)公司投身至此，但是日前也有一些新聞，如安斯泰來的基因治療管線臨床擱置，展現(xiàn)出對AAV載體的擔憂和顧慮。

由此，此次沙龍邀請了輝大基因BD副總裁張瑜先生、博騰生物首席技術(shù)官孔令潔博士、貝克曼庫爾特生命科學離心機產(chǎn)品經(jīng)理葉苗先生和丹納赫生命科學應用科學家徐玲麗女士四位業(yè)內(nèi)大咖來為大家分享AAV基因治療研發(fā)與開發(fā)上的一些經(jīng)驗，增強參與者對AAV領(lǐng)域技術(shù)和分析方法的了解，希望能夠促進AAV基因治療領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新，推動中國生物醫(yī)藥領(lǐng)域交流，助力中國生物制藥人才不斷發(fā)展。

▲丹納赫生命科學市場發(fā)展總監(jiān)周偉華

首先本場沙龍請到丹納赫生命科學市場發(fā)展總監(jiān)周偉華女士開場致辭?；蛑委熾y做，AAV更難做，但是基因治療一定是未來的主要治療手段，能從根本上治愈疾病。國內(nèi)的AAV基因治療才剛剛啟航，但是挑戰(zhàn)已經(jīng)接踵而來。

輝大基因BD副總裁張瑜：AAV基因治療藥物的開發(fā)的前沿進展

基因治療中分為兩類，一種是體外（ex vivo）基因治療，最典型的如CAR-T療法，另一種是體內(nèi)（in vivo）基因療法，主要以使用AAV病毒載體為主，將基因修飾工具引入到目標基因上，對目標基因進行修飾，達到治療目的。

基因治療的概念是1972年正式提出的，在1990年進行了第一次臨床試驗。2003年中國上市了全球第一個廣義上的基因治療產(chǎn)品今又生，是一款p53腺病毒注射液，用于治療腫瘤。除今又生外，至今為止全球共批準了五款基因治療產(chǎn)品。

相對病毒類載體，還有一類非病毒載體，如脂質(zhì)納米顆粒（LNP）等。其他的還有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、甲屬病毒載體、皰疹病毒載體、牛痘病毒載體等，多見于罕見病和慢性病的治療。

AAV載體的優(yōu)勢很多。如單鏈DNA既可以感染的細胞類別較廣，同時不會整合到人體基因組中，并且免疫原性相對較低，可以長時間存在。但是其弱勢在于，AAV載體攜帶目標基因的容量最好不要超過4.5kb，可包裝的基因片段較小。大約有30%的遺傳病基因超過了4.5kb，限制了AAV基因療法的應用。

在過去的近50年中，人類發(fā)現(xiàn)了不同的基因編輯工具，極大地拓展了基因治療的應用，包括CRISPR Cas9、TALEN、ZFN、CRISPR Cpf1等，各具不同的優(yōu)點。

Cas9系統(tǒng)目前是更靈活、更易成藥、脫靶率最低且成本最易控制的選擇。張瑜先生以已經(jīng)應用到臨床試驗中的EDIT-101和NTLA-2001為例，闡述了Cas9系統(tǒng)在基因治療產(chǎn)品中修飾人體編輯DNA的實際應用。

在創(chuàng)新的基因編輯工具中，張瑜先生介紹了輝大基因2020年開發(fā)的創(chuàng)新RNA編輯器工具Cas13X/Y，體積較小，但依然可以敲除至少4個基因，脫靶率較低，借此展現(xiàn)了基因編輯工具越來越小同時追求更高的效率的趨勢。

張瑜先生提到，基因治療在過去十幾年間得到大力發(fā)展，究其原因有幾個重要因素：基礎(chǔ)科研的推動，資本的青睞與支持，迫切的臨床需求，積極有效的監(jiān)管和已驗證的技術(shù)路徑。

接下來基因治療還面對著不小的挑戰(zhàn)。在產(chǎn)品研發(fā)方面，需解決脫靶問題、提高編輯效率、開發(fā)更小的系統(tǒng)，將基因治療的適應癥從罕見病向慢性病擴展。在遞送系統(tǒng)方面，還需提高組織特異性，降低毒性和免疫原性，使其更易生產(chǎn)和儲運，增強可調(diào)控性。在實際CMC生產(chǎn)方面，未來還需建立統(tǒng)一且優(yōu)化的行業(yè)標準，提高生產(chǎn)效率，提高生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，提供可靠的CDMO服務，多方面改善，以達到降低成本的核心要求。由此，推進基因治療產(chǎn)品更好地通過注冊審批。

博騰生物首席技術(shù)官孔令潔：AAV載體的工藝開發(fā)

▲博騰生物首席技術(shù)官孔令潔

目前市場上主要的兩類AAV包裝系統(tǒng)分別是HEK293轉(zhuǎn)染體系和昆蟲細胞桿狀病毒包裝系統(tǒng)。

HEK293系統(tǒng)使用三質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染HEK293細胞，周期較短，但缺點是產(chǎn)量低、成本高，工藝難以放大。

昆蟲細胞系統(tǒng)產(chǎn)量更高、成本低、空殼率低，工藝相對容易放大，但缺點是由于增加了病毒制備過程，因此周期長，桿狀病毒的不穩(wěn)定性會影響工藝放大，并有VP1/2/3比例引起的感染力問題和潛在的昆蟲彈狀病毒問題。

孔博士同時介紹了兩類AAV生產(chǎn)包裝系統(tǒng)的工藝流程對比。在上游工藝中，昆蟲桿狀病毒細胞的步驟相較更為復雜，需要經(jīng)過載體設(shè)計、桿狀病毒制備、轉(zhuǎn)染Sf9細胞、單噬斑篩選和鑒定、病毒擴增等步驟。除了昆蟲細胞系統(tǒng)需要額外的除病毒工藝外，二者下游的純化工藝基本相同，目前已經(jīng)能夠良好地去除空衣殼。

昆蟲細胞系統(tǒng)有其特有的技術(shù)壁壘，包括：早期的昆蟲細胞體系包裝的AAV相比HEK293系統(tǒng)感染力低，桿狀病毒的基因組不穩(wěn)定，和潛在的昆蟲彈狀病毒問題。盡管昆蟲細胞系統(tǒng)有較低的空殼率，但通過分子設(shè)計和工藝改善，還可以更加減少空殼病毒?？撞┦拷榻B了目前的解決方法和未來發(fā)展方向，部分問題已經(jīng)得到改善，但專利壁壘比較高。

貝克曼庫爾特生命科學離心機產(chǎn)品經(jīng)理葉苗：AAV載體的分離純化及空殼率檢測

目前的離心機樣式具有多樣性，隨著樣品的分離要求，包括體積要求，在不斷地變化，如臺式微量離心機，臺式高速離心機，然后再到兼顧了體積和離心力的落地高速或者落地大容量離心機，一直到追求極限離心力的超速離心機，包括臺式超速離心機等等。

離心機的主要的功能是對生物顆粒的分離制備，了解所需要分離的生物顆粒的沉降特性尤為重要，所以沉降系數(shù)生物顆粒是非常重要的一個物理參數(shù)。知道了沉降系數(shù)后，就可以針對性地采取不同的離心方法。

最簡單、最直接的一種離心方法就是沉淀和差速法，它的特點是比較快速簡單，一般適用于沉降系數(shù)差值比較大的生物顆粒的分離。缺點是分離精度較差，純度包括得率都較低。

若需求較好的分離精度，通常使用密度梯度離心的方法，在工業(yè)上常見用于分離病毒載體和操作性質(zhì)粒DNA的是等密度梯度濾芯。葉苗老師介紹了密度梯度離心主要的分類和應用條件，并介紹了密度梯度超速離心機（DGUC）的離心純化流程和應用的類型。

通常認為該方法的主要缺點是其通量和體積較小，但葉老師展示了相關(guān)文獻中顯示，通過實驗設(shè)計和參數(shù)優(yōu)化，可以在有限體積內(nèi)提升其分離通量，提高4倍的效率。

分析超離心法(AUC)可以精準監(jiān)測AAV載體的空殼率，并對蛋白質(zhì)、低聚物、聚集物、膠體、納米顆粒、病毒衣殼、VLPs、細胞外囊泡和其他小結(jié)構(gòu)分子進行表征。因此AUC可以用于篩選病毒載體和擴大生產(chǎn)質(zhì)量檢測。葉苗老師也通過展示AUC檢測空殼率的流程，展示了AUC的系統(tǒng)組成和相對電鏡法的技術(shù)優(yōu)勢，并以諾華的專利AAV基因治療產(chǎn)品為例，闡述了AUC檢測AAV空殼率的實際表現(xiàn)。

丹納赫生命科學應用科學家徐玲麗：毛細管電泳對AAV載體的表征

使用毛細管等電聚焦電泳對三種不同血清型AAV的等電點（pI值）進行檢測，顯示了AAV包裝核酸的不同狀態(tài)。該方法的特點為采用三種marker，pI值計算準確；采用30厘米長的毛細管進行分離，能得到較高的分辨率。如果只需粗略檢測空殼率，可選擇毛細管電泳法，若需要較高精度的空殼率，可選擇AUC方法。

病毒衣殼蛋白需要由正確的蛋白序列制成，并且它們通常需要加上特定的翻譯后基團才能在細胞中充分發(fā)揮活性。毛細管電泳可以采用凝膠電泳的模式對AAV衣殼蛋白的純度進行檢測，使用激光誘導熒光的檢測方法可對低至1X10¹⁰GC/mL的樣品進行檢測。而液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS / MS）可完成相關(guān)肽圖分析，X500B QTOF可繪制出AAV顆粒在細胞中發(fā)揮正常功能所需的主要蛋白質(zhì)序列和翻譯后修飾。

目前CDE對基因治療產(chǎn)品藥學研究與評價技術(shù)指導原則中建議對宿主細胞殘留DNA的片段進行檢測。之前的文獻中已使用毛細管電泳方法對片段檢測進行了嘗試，可以達到較好的定量限和檢出限。在實際中也對一些樣品進行了嘗試，在AAV和慢病毒中均可以檢測到宿主細胞殘留DNA的片段分布。

大咖分享結(jié)束后，現(xiàn)場參與的觀眾繼續(xù)參觀了丹納赫中國生命科學研究院應用研發(fā)中心，面對面互動體驗AAV載體分析設(shè)備與方法。

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