基因治療是將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者的細胞中以達到治療效果。治療性DNA大部分是使用基于腺病毒（Ad），腺相關(guān)病毒（AAV）和慢病毒（LV）等病毒載體系統(tǒng)進行遞送。隨著這些病毒載體作為臨床治療劑應用的增加，可擴展的商業(yè)化工藝（尤其是純化）正在被研究和優(yōu)化，以最大程度地確保關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）的保留。本文綜述了病毒載體純化技術(shù)及不同載體種類的不同特性對選擇最佳單元操作的影響。

每類病毒載體對基因治療中都有自己的挑戰(zhàn)與機會(表1)。腺病毒最初用于基因治療是在20年前，但它們現(xiàn)在很少在臨床應用(它們現(xiàn)在臨床應用并不受歡迎)，因為它們太復雜，比如具有挑戰(zhàn)性的載體設計和系統(tǒng)管理，龐大的基因組，以及（最重要的）高免疫原性(1)。

慢病毒已經(jīng)在臨床試驗中顯示出應用前景，它們已經(jīng)用于治療Wiskott-Aldrich綜合征，X連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(2–4)。慢病毒重要的作用機制（MoA）是它們能轉(zhuǎn)導分裂和不分裂細胞的能力，從而產(chǎn)生持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達和潛在的治療效果。

AAV也被認為是一種有前景的基因治療工具，因為它們沒有致病性和免疫原性，同時具有持續(xù)轉(zhuǎn)基因表達和適用于各種細胞的特點[5]。目前，西方國家唯一商業(yè)化的基因治療是來自uniQure的Glybera（alipogene tiparvovec），其基于AAV1并已被用于治療遺傳性脂蛋白脂肪酶缺乏癥（LPLD）。

表1.病毒載體綜述

* AAV =腺相關(guān)病毒，HSV =單純皰疹病毒，RCR =有復制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒，CNS =中樞神經(jīng)系統(tǒng)（包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞），VSV =水泡性口炎病毒，HFV =人泡沫病毒，DSP =下游工藝

基因治療應用需要有可以生產(chǎn)高純度和生物活性載體的大規(guī)模生產(chǎn)工藝，并且能滿足化學，制造和控制（CMC）的監(jiān)管要求。它們應該是穩(wěn)定的、可擴大的、成本效益的，并且非常適用于多種病毒載體（6）。如圖1所示，病毒載體的生產(chǎn)由上游和下游工藝過程組成，包括幾個步驟，取決于產(chǎn)品的病毒特性。

用于基因治療載體的病毒顆粒的上游工藝需要病毒生長和收獲，而下游工藝側(cè)重于病毒載體的純化。值得注意的是，病毒載體的下游純化占整體制造成本的大部分，并且是病毒載體制造的瓶頸（7）。可擴展的下游工藝包含澄清（微濾），捕獲（超濾/滲濾），純化（離子交換層析（IEX）和親和層析（AF）），和精制（尺寸排阻層析（SEC）和超濾）等幾個步驟。

由于每種病毒具有不同的生物化學和物理特性，所以病毒基因治療載體的純化必須根據(jù)各自特點做相應地調(diào)整。這個過程需要進行優(yōu)化，以保持病毒感染性（與產(chǎn)品功效和典型的釋放測定密切相關(guān)）并最大限度得到恢復。純化方法的選擇應該考慮病毒粒子大小和穩(wěn)定性，中性pH下的電荷和相對粒子穩(wěn)定性等特征。必須徹底了解純化過程，以確定影響最終產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。

圖1.病毒載體制備過程

病毒基因治療載體純化可以采取不同的方法，包括超速離心、膜過濾和柱層析法。 后兩者適合于工藝放大。

超速離心主要用于實驗室規(guī)模，不能工藝放大，因為可用的轉(zhuǎn)子通常只有小容量。超速離心經(jīng)常導致活性病毒顆粒的丟失，病毒聚集和剪切力是可以用來解釋的其中兩種原因（8）。與膜和柱層析相比，超速離心的自動化也是個有挑戰(zhàn)性的難題。它的使用會增加處理時間和產(chǎn)品降解的風險。

盡管柱色譜工具是可擴展的并且常用于生物分子純化，但它們不適合純化諸如DNA和病毒等的較大分子。在這種情況下，純化通常通過0.1μm基質(zhì)擴散來實現(xiàn)。

膜孔> 3μm的膜吸附器已成為流行的病毒純化工具。它們將病毒顆粒吸附到固相上。由于孔徑大，膜吸附器可以在更快的流速下工作，從而節(jié)約了的大量時間和商品成本（CoG）（9）。另一個優(yōu)勢是它們可以應用溫和的洗脫條件，這增加了保留病毒感染性的可能性（6）。圖2說明了如何利用膜吸附器實現(xiàn)病毒純化，并用珠子作為對比。

圖2：常規(guī)色譜與膜吸附的比較

色譜法可進一步分為四種模式，分別利用不同的機制實現(xiàn)病毒的純化。IEX是基于位于病毒衣殼外部的蛋白質(zhì)凈電荷。AF利用基質(zhì)偶聯(lián)受體或配體與病毒衣殼之間的相互作用。SEC（凝膠過濾）根據(jù)大小將病毒從DNA，衣殼和蛋白質(zhì)中分離出來。疏水作用層析（HIC）通過使用水性溶劑的疏水相互作用將病毒衣殼蛋白結(jié)合到基質(zhì)上（10）。

由于每種載體具有特定的特征，所以某些純化模式更易于發(fā)揮作用（表2）。為了純化腺病毒，即Ad5，可以使用上述所有的色譜方法。由于Ad病毒在中性pH下帶負電荷，因此可以使用各種陰離子交換吸附劑進行純化。

表2. 載體純化色譜產(chǎn)品

IEX =離子交換色譜; SEC =尺寸排阻色譜，AF =親和色譜

使用陰離子交換劑的IEX也被報道用于幾種AAV（11）。固定化金屬親和層析（IMAC）是可以純化Ad的另一種方法。該方法基于將Ad顆粒與結(jié)合到柱上的帶電鋅離子結(jié)合。該方法為純化AAV提供了幾種選擇，例如特別適用于AAV2純化的肝素親和層析（12）。SEC是適用于精制Ad和AAV5的方法，HIC可以用高濃度的硫酸銨和其他鹽（13）來純化Ad顆粒。后一種方法尚未被描述用于純化AAV血清型（10）。

由于慢病毒帶負電荷，所以純化慢病毒的常規(guī)方法是使用膜吸附器和捕獲步驟中使用的基于柱的AEX工具。這個步驟在不同的病毒載體純化組中變化最大。慢病毒也可以通過使用肝素親和層析來純化，但是它引入了一種動物來源的試劑，在大規(guī)模的基因治療生產(chǎn)中應該被淘汰[14]。最后，桿狀病毒通常在捕獲步驟中使用膜基陰離子交換劑，再用陰離子交換膜吸附劑和SEC來純化。

基因治療生物制備中的純化技術(shù)的選擇對終產(chǎn)品質(zhì)量和CoG非常重要，而且是一個多因素的過程。雖然用于基因治療的平臺化生物工藝不斷涌現(xiàn)，但它們尚未完全建立起來。

   每個載體都需要進行徹底的表征和工藝開發(fā)。然而，傳統(tǒng)的大規(guī)模純化技術(shù)（特別是色譜方法）非常適合基因治療生物工藝。因此尋求將基因工程方法中的新興基礎科學專業(yè)知識與已有的生物加工技能和技術(shù)相結(jié)合，以更好的服務于這個新興行業(yè)。

我們掌握了建立可持續(xù)和可獲利的基因治療產(chǎn)業(yè)所需的工具和技術(shù)。但是手中的挑戰(zhàn)是如何去最佳配置它們，以加速發(fā)展挽救生命和將有效的基因治療應用到臨床，而且還要有可以通過監(jiān)管部門的數(shù)據(jù)和能夠承擔的成本。