研究背景

        肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見的一種惡性腫瘤，同時(shí)，中國(guó)也是肝癌的癌癥大國(guó)。雖然現(xiàn)在的醫(yī)療診斷技術(shù)發(fā)展很快，但是，對(duì)與肝癌的現(xiàn)有診斷技術(shù)還是受限很大。因此，開發(fā)新的診斷biomarker，并理解這些biomarker的作用機(jī)制，是很多科研人員想做的事情。本研究從circRNA，一類非常適合做biomarker的候選分子出發(fā)，深入研究了一個(gè)鋅指家族基因ZKSCAN1及其產(chǎn)生的circZKSCAN1，在HCC中的作用機(jī)制及作為biomarker的潛在價(jià)值。

研究結(jié)果

1.基因表達(dá)模式分析

        ZKSCAN1，是一個(gè)鋅指蛋白家族，該家族基因在腫瘤發(fā)生，發(fā)展，轉(zhuǎn)移和藥物耐受方面都發(fā)揮著非常重要的作用。同時(shí)，現(xiàn)有的研究也發(fā)現(xiàn)，ZKSCAN1基因的第二個(gè)和第三個(gè)外顯子部分能形成一個(gè)circRNA，在人腦部和肝臟表達(dá)豐富。因此，研究人員首先驗(yàn)證了ZKSCAN1和circ ZKSCAN1在HCC組織中的表達(dá)情況。102個(gè)HCC組織和配對(duì)癌旁的RT-PCR結(jié)果顯示，他們?cè)贖CC樣本中的表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步將ZKSCAN1和circ ZKSCAN1的表達(dá)與臨床指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)低的ZKSCAN1表達(dá)與腫瘤大小顯著相關(guān)；而circ ZKSCAN1的表達(dá)與不同腫瘤數(shù)目，硬化程度，血管侵襲，微血管侵襲，腫瘤grade都顯著相關(guān)。ROC曲線分析顯示，circ ZKSCAN1的AUC值達(dá)到0.834，敏感性和特異性能達(dá)到82.2%和72.4%，相比而言，ZKSCAN1的AUC值只有0.474。因此，circ ZKSCAN1的表達(dá)更合適作為腫瘤組織的診斷biomarker。

2. circRNA與母基因表達(dá)相關(guān)性分析

        對(duì)于circRNA的研究，第一個(gè)想到的是circRNA的表達(dá)是否會(huì)和母基因表達(dá)有關(guān)聯(lián)。因此，研究人員先在不同人HCC細(xì)胞系中檢測(cè)了ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)所有的細(xì)胞系（Huh7, SMMC-7721, BEL-7402, HepG2和HepG3B）相比對(duì)照組（L02），表達(dá)都降低。通過在HepG2和SMMC7721中過表達(dá)和敲降ZKSCAN1和circZKSCAN1，研究人員發(fā)現(xiàn)過表達(dá)或者敲降其中一個(gè)，不會(huì)影響另一個(gè)的表達(dá)變化。因此，ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的表達(dá)彼此獨(dú)立，不相互影響。

3. 基因功能分析

        為探究ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1對(duì)HCC細(xì)胞的功能影響，研究人員進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果顯示，在ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的敲降細(xì)胞中，增殖能力顯著增強(qiáng)，而過表達(dá)細(xì)胞中，顯著下降；過表達(dá)細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低；敲降細(xì)胞顯著增加。進(jìn)一步的裸鼠種植實(shí)驗(yàn)也表明，過表達(dá)時(shí)腫瘤生長(zhǎng)抑制，而敲降時(shí)刺激腫瘤生長(zhǎng)。因此，ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有顯著影響。

4.基因亞細(xì)胞定位

        基因在細(xì)胞中的定位往往決定著他們的功能行使。因此，研究人員對(duì)ZKSCAN1的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，正常肝組織的細(xì)胞質(zhì)中存在大量的ZKSCAN1，而HCC肝組織中卻很少。另外，F(xiàn)ISH分析表明circ ZKSCAN1也是主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。

5.下游調(diào)控基因分析

        為探究ZKSCAN1調(diào)控細(xì)胞增殖和侵襲的內(nèi)在分子機(jī)制。研究人員對(duì)敲降ZKSCAN1 mRNA和circ ZKSCAN1的HCC細(xì)胞與對(duì)照進(jìn)行了全基因組RNA測(cè)序。結(jié)果顯示，敲降circZKSCAN1引起372個(gè)基因差異表達(dá)；敲降ZKSCAN1引起346個(gè)基因差異表達(dá)。其中，兩組結(jié)果中共有166個(gè)是在兩種情況下都出現(xiàn)差異。KEGG通路分析顯示，敲降circ ZKSCAN1的差異基因富集到PI3K pathway, migration pathway, actin cytoskeleton pathway等；而敲降ZKSCAN1則主要富集到metabolic pathways。因此，circ ZKSCAN1和ZKSCAN1影響了下游不同的信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖和侵襲。

6.qRT-PCR驗(yàn)證下游基因

       最后，研究人員對(duì)特異性地在ZKSCAN1敲降后變化的基因與circZKSCAN1敲降后變化的基因及都變化的基因進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，在ZKSCAN1敲降后，細(xì)胞代謝相關(guān)基因確實(shí)發(fā)生了顯著變化；而在circZKSCAN1敲降后，凋亡和遷移相關(guān)基因發(fā)生顯著變化；COL3A1，CDH5，MYB，PDK1和BCL2在兩種情況下都顯著變化。

研究結(jié)論

        在本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)，雖然ZKSCAN1和circRNA在HCC中都發(fā)生了顯著下調(diào)，都是影響細(xì)胞生長(zhǎng)，遷移和侵襲，但是，他們影響的下游信號(hào)通路卻是各不相同。該研究為理解circRNA和其母基因在生命體中的調(diào)控作用提供了新的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

Yao Z, Luo J, Hu K，et al.（2017）ZKSCAN1 gene and its related circular RNA (circZKSCAN1) both inhibit hepatocellular carcinomacell growth, migration and invasion but through different signaling pathways. Mol Oncol. doi: 10.1002/1878-0261.12045