circRNA研究方案和案例解析

迷途中小小書童 2019-09-10

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circRNAs（Circular RNAs，環(huán)狀RNA分子）是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子。circRNA是區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的一類新型RNA，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大量存在于真核轉(zhuǎn)錄組中。

大部分的環(huán)狀RNA 是由外顯子序列構(gòu)成，在不同的物種中具有保守性，同時存在組織及不同發(fā)育階段的表達(dá)特異性。由于環(huán)狀RNA對核酸酶不敏感，所以比線性RNA更為穩(wěn)定，這使得環(huán)狀RNA在作為新型臨床診斷標(biāo)記物的開發(fā)應(yīng)用上具有明顯優(yōu)勢。

漢恒circRNA環(huán)化系統(tǒng)，表達(dá)倍數(shù)高，100%成環(huán)

我們已知的circRNA功能有如下三種：

1）調(diào)節(jié)miRNA活性-ceRNA作用模式；

2）調(diào)節(jié)選擇性剪接（alternative splicing）-與pre-mRNA競爭剪接；

3）調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白（RBPs）的存儲，分類和定位-與蛋白直接結(jié)合；

上述三種circRNA機(jī)制作用方式，2）和3）由于需要用到RIP或RNA pull-down，實驗執(zhí)行難度大風(fēng)險高，而1）調(diào)節(jié)miRNA活性-ceRNA作用模式的可行性及陽性率較高，是目前研究最熱門的circRNA作用方式。

目前對于circRNA的研究還只是冰山一角，circRNAs的生物學(xué)功能也有待挖掘，因此是非常值得深入的研究方向。我們先來看看常規(guī)的circRNA研究思路（圖1）

圖1 circRNA常規(guī)研究思路

漢恒生物為了更好的幫助各位開展circRNA 的研究課題，我們的研究團(tuán)隊提出了基于ceRNA調(diào)控機(jī)制的circRNA系統(tǒng)研究方案。大致流程如下：

圖2漢恒生物circRNA研究流程示意圖

我們以hsa_circ_000244為例，來詳細(xì)解讀下cirRNA的系統(tǒng)研究方案。研究方向：前列腺癌。

驗證circRNA的表達(dá)水平

以前列腺癌組織和癌旁組織的cDNA為樣本，qPCR驗證hsa_circ_000244的表達(dá)量及是否成環(huán)。

漢恒生物擁有的circRNA-qPCR驗證技術(shù)，可設(shè)計特殊的circRNA驗證引物，既可驗證circRNA表達(dá)水平，同時又能區(qū)分成環(huán)與未成環(huán)RNA。

預(yù)測hsa_circ_000244可能結(jié)合的miRNAs

miRNAs信息學(xué)篩選及熒光素酶篩選驗證

將hsa_circ_000244序列克隆構(gòu)建至報告基因載體psiCHECK，合成上述預(yù)測到的miRNAmimics及對照，在293T細(xì)胞內(nèi)同時轉(zhuǎn)染miRNAmimics和psiCHECK-hsa_circ_000244，多功能酶標(biāo)儀檢測報告基因的表達(dá)水平，并篩選報告基因表達(dá)下調(diào)的miRNAs（可能有多個，本例中假定選擇hsa-miR-301a-3p進(jìn)行后續(xù)研究）

miRNA靶基因預(yù)測與功能富集分析

對hsa-miR-301a-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測，結(jié)果如下：

通過功能富集分析將前列腺癌相關(guān)的基因篩選出來：

miRNA靶基因篩選、驗證及相關(guān)功能研究

（1）初篩：qPCR驗證上述靶基因在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)量差異，篩選與hsa_circ_000244表達(dá)呈正相關(guān)的靶基因（本例中hsa_circ_000244在癌組織中表達(dá)較低，因此需要篩選在癌組織中表達(dá)量較低的靶基因）；

（2）進(jìn)一步篩選：在前列腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)hsa_circ_000244（使用漢恒生物的超強(qiáng)成環(huán)系統(tǒng)HBcirc-EnhancedTM circRNA慢病毒或腺病毒工具），qPCR驗證上述靶基因表達(dá)水平。

漢恒生物HBcirc-EnhancedTM circRNA環(huán)化載體系統(tǒng)（圖譜如下），上下游的成環(huán)元件經(jīng)過精心設(shè)計、優(yōu)化和驗證，可以達(dá)到100%成環(huán)、表達(dá)倍數(shù)高的效果并可獲得全長過表達(dá)circRNA的腺病毒，慢病毒或腺相關(guān)病毒，適用于各種細(xì)胞和動物模型。

選擇hsa_circ_000244過表達(dá)后，表達(dá)量也明顯上調(diào)的靶基因作為研究對象，本例中假定為PTEN基因。查詢PTEN的功能，發(fā)現(xiàn)它主要與細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)。

（3）在前列腺癌細(xì)胞系中封閉hsa-miR-301a-3p（使用漢恒生物的慢病毒或腺病毒工具），WB和qPCR檢測PTEN的表達(dá)水平；

（4）在前列腺癌細(xì)胞系中封閉hsa-miR-301a-3p（使用漢恒生物的慢病毒或腺病毒工具），通過細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲等實驗，確定hsa-miR-301a-3p對細(xì)胞功能的影響；

（5）雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒簶?gòu)建PTEN 3’UTR報告基因載體，將hsa-miR-301a-3p mimics與報告基因載體共轉(zhuǎn)293T工具細(xì)胞，多功能酶標(biāo)儀檢測報告基因的表達(dá)水平，闡明hsa-miR-301a-3p作用于PTEN的分子機(jī)制；

注：為了實驗的嚴(yán)謹(jǐn)性，可加入PTEN3’UTR區(qū)hsa-miR-301a-3p預(yù)測結(jié)合區(qū)域的突變體作為對照，進(jìn)一步說明問題。

（6）前列腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)hsa_circ_000244，檢測hsa-miR-301a-3p和PTEN的表達(dá)水平及細(xì)胞功能學(xué)研究：

在前列腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)hsa_circ_000244（使用漢恒生物的成環(huán)系統(tǒng)HB circ-EnhancedTMcircRNA慢病毒或腺病毒工具），然后分別進(jìn)行如下實驗：

1）WB和qPCR檢測PTEN表達(dá)水平；

2）qPCR檢測hsa-miR-301a-3p表達(dá)水平；

3）細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲等實驗，研究hsa_circ_000244對細(xì)胞功能的影響；

circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的驗證

漢恒生物-circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控機(jī)制研究解決方案：基于ceRNA作用方式和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，證明circRNA可rescue下游miRNA對其靶基因的抑制作用。

本實例的具體流程如下：

使用步驟5（5）中構(gòu)建的PTEN3’UTR報告基因載體和步驟5（2）中構(gòu)建的hsa_circ_000244過表達(dá)載體，將兩者共轉(zhuǎn)至293T工具細(xì)胞中，多功能酶標(biāo)儀檢測報告基因的表達(dá)水平，可間接證明hsa_circ_000244通過海綿吸附hsa-miR-301a-3p，從而上調(diào)PTEN靶基因的表達(dá)。

注：為了實驗的嚴(yán)謹(jǐn)性，可加入PTEN 3’UTR區(qū)hsa-miR-301a-3p預(yù)測結(jié)合區(qū)域的突變體作為對照，進(jìn)一步說明問題。

參考文獻(xiàn)

1、Circular RNAs:diversity of form and function. Lasda E, Parker R. RNA. 2014 Dec;20(12):1829-42.

2、Circular RNAs are alarge class of animal RNAs with regulatory potency. Memczak S, Jens M,Elefsinioti A, Torti F, Krueger J, Rybak A, Maier L, Mackowiak SD, GregersenLH, Munschauer M, Loewer A, Ziebold U, Landthaler M, Kocks C, le Noble F, RajewskyN. Nature. 2013 Mar21;495(7441):333-8.

3、Circular RNA profilingreveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiplemiRNAs. Zheng Q, Bao C, Guo W, Li S, Chen J, Chen B, Luo Y, Lyu D, Li Y, Shi G,Liang L, Gu J, He X, Huang S.NatCommun. 2016Apr 6;7:11215.

4、Circular RNA Related tothe Chondrocyte ECM Regulates MMP13 Expression by Functioning as a MiR-136'Sponge' in Human Cartilage Degradation. Liu Q, Zhang X, Hu X, Dai L, Fu X,Zhang J, Ao Y. Sci Rep. 2016 Mar2;6:22572. D