論文：CircRNA expression profile and functional analysis in testicular tissue of patients with non-obstructive azoospermia（非梗阻性無精子癥睪丸組織CircRNA表達(dá)譜及功能分析）

背景

不孕癥是一個(gè)世界性的生殖健康問題，影響到全球約7000萬人。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，有10-15%的夫婦患有不孕癥，男性因素約占所有不孕病例的一半。

不幸的是，近60-75%的男性不育原因不明或特發(fā)性，因?yàn)檫@些缺陷的分子機(jī)制尚不清楚。非梗阻性無精子癥(NOA)是男性不育最嚴(yán)重的表現(xiàn)，精子發(fā)生過程受到干擾。影響1%的男性和10%尋求生育援助的人。

研究還表明，NOA約占無精子癥的60%，其中精子發(fā)生過程不活躍，因此不能產(chǎn)生精子細(xì)胞。到目前為止，NOA是一種多因素紊亂，其分子基礎(chǔ)尚不清楚。

雖然顯微解剖睪丸精子摘除術(shù)(Microtese)是NOA的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但約50%的患者不能成功地進(jìn)行精子摘除。因此，我們面臨的挑戰(zhàn)是闡明精子發(fā)生過程中的精確分子機(jī)制，為NOA患者尋找有效的診斷指標(biāo)或治療靶點(diǎn)。

因此，本研究旨在研究mRNA在NOA患者中的表達(dá)譜和功能。生物信息學(xué)分析還可用于鑒定圓環(huán)RNA/miRNA/mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)、生物過程和信號(hào)通路。這些結(jié)果為開發(fā)新的NOA診斷和治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。

材料和方法

· 病人和方法

· RNA提取與質(zhì)量控制

· CircRNA微陣列標(biāo)記和雜交

· 微陣列數(shù)據(jù)采集與分析

· 用qRT-PCR方法驗(yàn)證圓環(huán)RNA

· CircRNA/miRNA相互作用及圓環(huán)RNA/miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

· 生物信息學(xué)分析

· 統(tǒng)計(jì)分析

在正常人睪丸和NOA睪丸中的差異

分層聚類圖顯示NOA患者睪丸組織及對(duì)照組的圓環(huán)RNA表達(dá)譜。方框圖表明，歸一化后NOA和對(duì)照的圓環(huán)RNA分布基本相同。散點(diǎn)圖顯示NOA與對(duì)照組圓環(huán)RNA表達(dá)的差異。

散點(diǎn)圖中的X和Y軸值是樣本的歸一化信號(hào)值（log2標(biāo)度）。綠線是折換線。頂綠線上方和底綠線下方的圓環(huán)RNA表明，兩種樣品的圓環(huán)RNA變化均在2.0倍以上。如果CircRNA至少有兩倍的上調(diào)或下調(diào)，則它們被認(rèn)為具有顯著的差異表達(dá)。

共檢測(cè)到4169個(gè)人圓環(huán)RNA。其中526個(gè)人圓環(huán)RNA表達(dá)上調(diào)，368個(gè)在NOA患者睪丸組織中表達(dá)下調(diào)(AFC>2.0和P?<?0.05). According to the genomic origin of human circRNAs, the classification of the differentially expressed circRNAs was summarized in pie chart (Fig. 1d)。

它們大多屬于外顯子類圓環(huán)RNA。具體而言，526個(gè)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子由479個(gè)外顯子、26個(gè)內(nèi)含子、8個(gè)反義和13個(gè)基因內(nèi)組成。此外，368個(gè)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子包括316外顯子，31個(gè)內(nèi)含子，6個(gè)反義和15個(gè)基因內(nèi)。1d)。

用qRT-PCR驗(yàn)證鏡像陣列數(shù)據(jù)

為證實(shí)crRNA微陣列結(jié)果，隨機(jī)選取6種差異表達(dá)的crRNA進(jìn)行了qRT-PCR分析，包括3種上調(diào)的crRNA(hsa_CIRC_0058058、hsa_CIRC_0008045和hsa_CIRC_0023313)和3種下調(diào)的圓環(huán)RNA(hsa_CIRC_0061817、hsa_CIRC_0002023和hsa_CIRC_0008533)，其中hsa_CIRC_0058058、hsa_CIRC_0008045和hsa_CIRC_0023313。

結(jié)果表明，所篩選的圓環(huán)RNA的表達(dá)模式與微陣列數(shù)據(jù)一致。其中HSA_CIRC_0023313(對(duì)照1.30±1.33，NOA 16.46±2.81，P=0.002)，hsa_circ_0008045(對(duì)照1.00±0.32，NOA 4.12±0.51，P和HSA_CIRC_0058058(控制值0.98±0.43，NOA 16.93±1.48)，PHsa_CIRC_0061817(對(duì)照組1.04±0.24，NOA 0.58±0.19)。

P=0.061)，hsa_circ_0002023(對(duì)照1.00±0.29，NOA 0.46±0.13，P和hsa_circ_0008533(對(duì)照0.99±0.26，NOA 0.60±0.16)，PNOA患者與對(duì)照組比較，其表達(dá)水平明顯下降(P<0.012)。

CircRNA/miRNA相互作用分析

已有研究表明，圓環(huán)RNA作為miRNA“海綿”，具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA活性和進(jìn)一步調(diào)控基因表達(dá)的功能。為了尋找潛在的環(huán)RNA/miRNA在NOA中的相互作用，選擇了一種已證實(shí)的圓環(huán)RNA(Hsa_CrcRNA_0023313)進(jìn)行進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)。

對(duì)于hsa_CircRNA_0023313，最有可能的靶基因是hsa-miR-520 d-3p，hsa-miR-373-3p，hsa-miR-372-3p，hsa-miR-302C-3p和hsa-miR-130 b-5p。MiRNA反應(yīng)元件(MRES)的序列分析如圖所示。

“2D結(jié)構(gòu)”顯示MRE序列、目標(biāo)miRNA種子類型和3‘配對(duì)序列。“本地AU”顯示了Au含量為30 nt的上游和下游種子序列。紅條代表A/U和高可達(dá)性，黑條代表G/C和種子的低可達(dá)性。此外，可訪問性的程度是由桿的高度來表示的?！拔恢谩北硎驹趆sa_crcRNA_002313線性表示上最有可能的相對(duì)MRE位置。

RNA相互作用網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)

圓環(huán)RNA/微RNA/mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)hsa_crna_0023313-靶向miRNAs（包括hsa-miR-520 d-3p，hsa-miR-373-3p，hsa-miR--302C-3p和hsa-miR-130 b-5p)的預(yù)測(cè)目標(biāo)基因。

GO分析與KEGG通路分析

Go分析和KEGG通路分析預(yù)測(cè)hsa_crcRNA_0023313的潛在生物學(xué)功能。對(duì)hsa_CircRNA_0023313的細(xì)胞成分分析表明，其靶基因主要涉及細(xì)胞質(zhì)、胞漿、自噬體和自噬體。

生物過程分析表明，其靶基因主要參與轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA模板化、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和共價(jià)染色質(zhì)修飾等。此外，分子功能分析表明hsa_CircRNA_0023313主要參與泛素-蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、染色質(zhì)結(jié)合和ATP-結(jié)合等。

KEGG分析表明，與hsa_CircRNA_0023313相關(guān)的前五條途徑分別為內(nèi)吞、減數(shù)分裂、FoxO信號(hào)通路、Ubiquitin介導(dǎo)的蛋白水解和AMPK信號(hào)通路。

結(jié)論

綜上所述，本研究首次闡明了周期RNA在NOA患者睪丸組織中的綜合表達(dá)模式，提示其可能在調(diào)節(jié)精子發(fā)生中起重要作用，可能是NOA診斷和治療的潛在分子靶點(diǎn)。然而，對(duì)于圓環(huán)RNA在精子發(fā)生中的具體作用的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步的探索。

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