胃癌（GC）是一種致命的疾病，在眾多病因中，幽門螺桿菌（H. pylori）感染是最強(qiáng)的治病因素。然而，幽門螺桿菌相關(guān)GC的潛在遺傳和分子機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。我們研究了幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC之間競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）網(wǎng)絡(luò)之間的差異。

    從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了32個(gè)癌旁，18個(gè)幽門螺桿菌(+)和141個(gè)幽門螺桿菌(-)樣本的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），microRNA (miRNA)和信使RNA(mRNA)數(shù)據(jù)。構(gòu)建了幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA網(wǎng)絡(luò)后，使用Panther和Kobas數(shù)據(jù)庫分析了基因本體論（GO）和KEGG Pathway。最后用生存分析找到關(guān)鍵基因。在幽門螺桿菌(+)GC中我們發(fā)現(xiàn)了一共有1,419個(gè)lncRNAs、82個(gè)miRNAs、和 2,501個(gè)mRNAs是表達(dá)差異的。在幽門螺桿菌(-)GC中有2,225個(gè)lncRNAs、130個(gè)miRNAs和3,146個(gè)mRNAs有差異。

    此外，在幽門螺桿菌(+)GC中富集到三個(gè)獨(dú)特的通路（細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，HIF-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑），根據(jù)總體生存分析，有3個(gè)lncRNA (AP002478.1,LINC00111和LINC00313) 和2個(gè)mRNAs (MYB和COL1A1)可以作為幽門螺桿菌(+)GC患者的預(yù)后生物標(biāo)志物。結(jié)論，我們的研究已經(jīng)確定了幽門螺桿菌(+)和幽門螺旋桿菌(-)GC之間ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的差異，可以為將來的研究提供候選信息。

    胃癌（GC）是世界上最常見的癌癥之一，也是癌癥死亡第二大常見原因。GC患者因?yàn)榧膊〉陌l(fā)現(xiàn)晚，導(dǎo)致五年生存率很低。在幾種與腫瘤相關(guān)的因素中，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將幽門螺桿菌的感染歸類為Ⅰ型致癌物，幽門螺桿菌是一種革蘭氏陰性菌，世界上一半的人口在童年時(shí)期感染了幽門螺旋桿菌。幽門螺桿菌感染改變了宿主細(xì)胞中的基因表達(dá)。持續(xù)的幽門螺桿菌感染可能導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)，然后引發(fā)一系列胃粘膜轉(zhuǎn)化：發(fā)生非萎縮性胃炎，然后變成多灶性萎縮性胃炎，腸上皮化生，發(fā)育不良；最后，一些被感染的病人會(huì)患上胃癌。找出GC中幽門螺桿菌致病因素如何改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，是非常重要的。只有2％的人類轉(zhuǎn)錄組是蛋白質(zhì)編碼RNA，另外98％是非編碼RNA。然而，最近幾年研究人員注意到，非編碼RNA可實(shí)現(xiàn)多種生物學(xué)功能。在非編碼RNA中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是長(zhǎng)度超過200bp的轉(zhuǎn)錄本，不能翻譯蛋白質(zhì)。lncRNA保守性差，通過順式（cis）或反式（trans）作用機(jī)制，對(duì)基因表達(dá)通路實(shí)現(xiàn)多級(jí)監(jiān)管，例如轉(zhuǎn)錄，表觀遺傳學(xué)和翻譯。

   人類疾病，特別是增殖性疾病，許多l(xiāng)ncRNA都出現(xiàn)表達(dá)模式的改變，表明lncRNAs在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面很重要。另一種小的非編碼RNAs稱為microRNAs (miRNAs),通常是22個(gè)核苷酸，是進(jìn)化上保守的單鏈RNA分子。他們通過與mRNA的3’UTR配對(duì)來負(fù)調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)。在腫瘤疾病中，異常表達(dá)的miRNA在細(xì)胞增殖，遷移和侵襲中扮演重要角色。

   根據(jù)最近發(fā)現(xiàn)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（ceRNA）分子機(jī)制假說，mRNA和lncRNA共享一個(gè)或多個(gè)miRNA反應(yīng)元件（MREs），并可作為天然miRNA海綿，這導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)miRNA功能下調(diào)?，F(xiàn)在已知lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)主要參與啟動(dòng)、進(jìn)展、入侵、和癌癥的轉(zhuǎn)移。ceRNA網(wǎng)絡(luò)的不平衡可能導(dǎo)致疾病發(fā)病機(jī)制。一些與幽門螺桿菌GC相關(guān)的非編碼RNA已經(jīng)被報(bào)道了。據(jù)報(bào)道，lncRNA AF147447對(duì)幽門螺桿菌相關(guān)GC有抑制作用。Serum H19, LINC00152, 和Lnc-SGK1可作為幽門螺桿菌GC診斷的潛在生物標(biāo)志物。

   在幽門螺桿菌(+)GC血清中，miR-146,miR-375和Let-7被下調(diào)，但miR-19和miR-21是上調(diào)的，用于幽門螺桿菌的清除。據(jù)報(bào)道，在幽門螺桿菌相關(guān)的GC病因?qū)W中MiR-124可以通過抑制DNA損傷起到保護(hù)作用。幽門螺桿菌(+)GC中miR128/miR148a的下調(diào)導(dǎo)致MMPs/E-鈣粘蛋白（E-cadherin)通路的激活并誘導(dǎo)GC細(xì)胞的遷移和侵襲。幽門螺桿菌感染通過增加miR-100的水平可能引起胃上皮屏障功能障礙。在幽門螺桿菌感染中，miR-195和 miR-488在控制IL-6活性上似乎扮演重要角色。來自幽門螺桿菌的CagA下調(diào)miR-320a和miR-4496然后促進(jìn)GC-起始細(xì)胞特性。然而，幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC之間的復(fù)雜RNA干擾差異尚未得到充分研究。這凸顯了研究ceRNA網(wǎng)絡(luò)占據(jù)幽門螺桿菌相關(guān)GC致癌的重要性。

  在這里我們從TCGA數(shù)據(jù)庫中收集了GC三種RNA的表達(dá)數(shù)據(jù)及其臨床數(shù)據(jù)。因?yàn)槿藗兤毡檎J(rèn)為GC是一種異質(zhì)性癌癥，幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC可能在幾個(gè)方面存在重大差異：臨床、病理、分子和細(xì)胞異質(zhì)性。這是第一項(xiàng)針對(duì)幽門螺桿菌相關(guān)GC ceRNA網(wǎng)絡(luò)的研究。分析差異表達(dá)基因后，我們比較了幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC之間ceRNA網(wǎng)絡(luò)，相關(guān)的富集分析結(jié)果和與總生存時(shí)間相關(guān)的關(guān)鍵基因。最后，我們發(fā)現(xiàn)了一些RNA與幽門螺桿菌(+)GC密切相關(guān)。所有這些結(jié)果為更好的理解幽門螺桿菌(+)ceRNA相關(guān)發(fā)病機(jī)制提供了可能。

   從GDC Data Portal（https://portal.gdc.）獲得胃腺癌和癌旁組織的原始RNA和miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)。使用Ensembl數(shù)據(jù)庫（http://www.），我們重新注釋RNA探針并獲得mRNA和lncRNA表達(dá)譜。這些GC樣本的相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)，含有幽門螺桿菌感染信息，也是從TCGA數(shù)據(jù)庫下載的。然后我們手動(dòng)將每個(gè)樣本分為兩組：幽門螺桿菌(+)組和幽門螺桿菌(-)組。最后，我們獲得了幽門螺桿菌(+)和幽門螺旋桿菌(-)GC的lncRNA，miRNA和mRNA的表達(dá)譜。

    使用R軟件和edgeR Bioconductor包將RNA表達(dá)數(shù)據(jù)做標(biāo)準(zhǔn)化。我們?cè)谟拈T螺桿菌(+)和幽門螺旋桿菌(-)GC組織與相鄰的非癌組織中找到了lncRNAs（DElncRNA），miRNAs（DEmiRNA）和mRNAs（DEmRNA）的差異表達(dá)，3種RNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)(1)差異倍數(shù)（log2 FC）> 1.5; (2)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.05。使用gplots>

? 圖1 幽門螺桿菌(+)/(-)GC中差異表達(dá)RNA的聚類圖。

   行代表RNA，而列代表幽門螺桿菌(+)/(-)GC樣品，log2FC > 1.5且FDR <>

（a-c）幽門螺桿菌(+)GC中差異表達(dá)的lncRNA，miRNA和mRNA;

（d-f）幽門螺桿菌(-)GC中差異表達(dá)的lncRNA，miRNA和mRNA。

? 圖2 火山圖用log2FC > 1.5 和 FDR < 0.05="">

（a-c）幽門螺桿菌(+)GC中差異表達(dá)的lncRNA、miRNA和mRNA;

（d-f）幽門螺桿菌(-)GC中差異表達(dá)的lncRNA、miRNA和mRNA。

    首先我們用starBase v2.0（http://starbase.）將DEmiRNA的名稱轉(zhuǎn)化為人類成熟miRNA名稱。在該研究中，使用miRcode database (http://www.)數(shù)據(jù)庫整合lncRNA-miRNA相互作用對(duì)。然后，DEmiRNA靶基因是使用三個(gè)數(shù)據(jù)庫miRDB、miTarBase、和TargetScan預(yù)測(cè)到的，存在于所有三個(gè)數(shù)據(jù)庫中的基因被認(rèn)為是這些DEmiRNA的靶基因。將預(yù)測(cè)到的靶基因與TCGA GC樣品中差異的基因進(jìn)行比較，只有重疊的基因和他們的相互作用對(duì)，才會(huì)被用于進(jìn)一步分析。

通過Cytoscape軟件根據(jù)lncRNA-miRNA對(duì)和miRNA-mRNA對(duì)，構(gòu)建幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。

? 圖3，幽門螺桿菌(+)GC的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)。

網(wǎng)絡(luò)中的LncRNA，miRNA和mRNA分別表示為菱形，矩形和圓形

條形圖顯示了在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中具有最高交互數(shù)的關(guān)鍵基因。

? 圖4，幽門螺桿菌(-)GC的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)

網(wǎng)絡(luò)中的LncRNA，miRNA和mRNA分別表示為菱形，矩形和圓形

條形圖顯示了在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中擁有最高交互數(shù)的關(guān)鍵基因

    為了對(duì)比幽門螺桿菌(-)ceRNA網(wǎng)絡(luò)與幽門螺桿菌(+)網(wǎng)絡(luò)中差異mRNA的不同生物學(xué)過程的注釋，使用基因本體論（GO）進(jìn)行生物過程富集分析。KOBAS 3.0在線數(shù)據(jù)庫（http://kobas.cbi。pku.edu.cn）用于進(jìn)行基因和基因組的KEGG通路富集分析，然后找到幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC潛在途徑。GO和KEGG顯著的標(biāo)志是FDR＜0.05. 最后，我們比較了幽門螺桿菌(+)GC與幽門螺桿菌(-)GC的富集結(jié)果，并使用ggplot2和GOplot R包顯示結(jié)果。

? 圖5，幽門螺桿菌(+)GC的ceRNA網(wǎng)絡(luò)的GO生物過程和KEGG分析

(a) 特有的KEGG結(jié)果分析; 

(b) 幽門螺桿菌(+)和幽門螺旋桿菌(-)GC之間KEGG分析的共有結(jié)果。

hsa04933：糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路。

hsa05206：癌癥中的微小RNA。

hsa04115：p53信號(hào)通路。

hsa04151：PI3K-Akt信號(hào)通路。

hsa04015：Rap1信號(hào)通路。

hsa04014：Ras信號(hào)通路;

(c) GO生物過程分析的獨(dú)特結(jié)果;

(b) 幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC之間共同的GO分析結(jié)果（biological proces）

? 圖6，幽門螺桿菌(-)GC的ceRNA網(wǎng)絡(luò)的GO（biological proces）和KEGG分析結(jié)果

（a）特有的KEGG結(jié)果

（b）幽門螺桿菌(+)和幽門螺旋桿菌(-)GC之間共同的KEGG分析結(jié)果。

hsa04933：糖尿病患者的AGE-RAGE信號(hào)通路并發(fā)癥。

hsa05206：癌癥中的microRNAs。

hsa04115：p53信號(hào)通路。

hsa04151：PI3K-Akt信號(hào)通路。

hsa04015：Rap1信號(hào)通路。

hsa04014：Ras信號(hào)通路;

（c）GO生物過程分析的特有結(jié)果;

（d）幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)GC之間共同的GO結(jié)果（biologicalProcess）

     在測(cè)試了ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的所有RNA后，獲得了幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)患者的生存曲線，如圖7所示。對(duì)于幽門螺旋桿菌(+)患者，三種lncRNA：AP002478.1，LINC00111和LINC00313，以及兩種mRNA：MYB和COL1A1是與存活時(shí)間相關(guān)的RNA（p值<>

（b）LINC00313可能是COL1A1的ceRNA，它們都與hsa-miR-143相互作用。此外，所有五個(gè)生存結(jié)果都是幽門螺桿菌(+)GC特有的。

? 圖７，幽門螺桿菌(+)GC的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中RNA的總體存活分析

    作為I型致癌物，幽門螺旋桿菌與各種胃病相關(guān)。發(fā)展中國(guó)家成年人幽門螺桿菌的流行率高于發(fā)達(dá)國(guó)家。感染幽門螺桿菌的大多數(shù)人患有無癥狀性胃炎，幽門螺桿菌(+)患者中有10-20％可能出現(xiàn)消化性潰瘍，這些感染者中有1％有患胃腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。雖然已經(jīng)對(duì)幽門螺桿菌相關(guān)癌變進(jìn)行了大量研究，但幽門螺桿菌誘導(dǎo)的胃腫瘤發(fā)病機(jī)制尚不明確。因此，為了早期診斷和找到更好的治療靶點(diǎn)尋找獨(dú)特的標(biāo)記物在征服幽門螺桿菌(+)GC中起重要作用。我們的整個(gè)工作流程如圖8所示。在我們的研究中，在幽門螺桿菌(+)GC中共有1,419個(gè)lncRNA，80個(gè)miRNA和2,501個(gè)mRNA具有差異；在幽門螺桿菌(-)GC中有2,225個(gè)lncRNA，130個(gè)miRNA和3,146個(gè)mRNA是差異的。

? 圖８，用于評(píng)估幽門螺桿菌(+)和幽門螺桿菌(-)RNA表達(dá)數(shù)據(jù)的一般工作流程。