非酒精性脂肪肝疾病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種在無(wú)大量飲酒的患者肝臟中出現(xiàn)過(guò)量脂肪堆積而產(chǎn)生的類似于酗酒造成的肝臟損傷。而非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是NAFLD 的一種形式，除了肝臟中過(guò)量的脂肪堆積外，還伴隨著肝臟炎癥和不同程度的肝臟損傷。盡管多數(shù)NASH患者并無(wú)明顯癥狀，但NASH可能進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，甚至是肝癌。NASH在超重或肥胖的中年人群中比較常見(jiàn)，通常伴隨著高血脂（膽固醇和甘油三酯水平升高）和糖尿病的出現(xiàn)。NASH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前還沒(méi)有直接有效的藥物，治療方式主要是進(jìn)行生活方式的干預(yù)，包括減輕體重、改變飲食、加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)以及避免飲酒和服用不必要的藥物等[1]。因此，建立可靠的動(dòng)物模型對(duì)探索NASH的發(fā)病機(jī)制及治療手段十分重要。

Henrik等人通過(guò)構(gòu)建Gubra-Amylin NASH (GAN) 飲食誘導(dǎo)肥胖 (diet-induced obese，DIO) 小鼠模型（GAN DIO-NASH小鼠），在體內(nèi)模擬NASH患者中的肝臟纖維化，并對(duì)該模型進(jìn)行了臨床轉(zhuǎn)化性的評(píng)估[2]。

該研究使用含40%飽和脂肪、22%果糖和2%膽固醇的GAN飼料喂養(yǎng)C57Bl/6J小鼠38周以上，對(duì)代謝參數(shù)、血漿和肝臟的生物標(biāo)志物進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)，也對(duì)小鼠肝臟病理學(xué)特征和轉(zhuǎn)錄組特性進(jìn)行了評(píng)估，并與體重正常的健康人和NASH患者進(jìn)行了對(duì)比。

GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者的肝臟組織具有相似的病理學(xué)特征和量變

NASH 的主要病理學(xué)改變包括脂肪變性（steatosis），肝細(xì)胞氣球樣變（ballooning degeneration）、小葉炎癥（inflammation）和纖維化（fibrosis）。雖然肝纖維化實(shí)際上并不參與NAFLD活動(dòng)評(píng)分（NAFLD activity score，NAS），但纖維化程度可以用于預(yù)后評(píng)估。

肝臟組織切片顯示，GAN DIO-NASH小鼠與NASH患者在脂肪變性、炎癥病灶和肝細(xì)胞氣球樣變上具有相似的形態(tài)學(xué)特征（圖1）。在GAN DIO-NASH小鼠肝小葉中，肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積呈分散式分布，主要表現(xiàn)為大泡性脂肪變性（macrovesicular steatosis）；且炎癥病灶中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞。此外，在GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者中，肝小葉3區(qū)均能觀測(cè)到肝細(xì)胞氣球樣變，且兩者竇周隙膠原纖維的分布特征也相似。輕度纖維化（F1期）的GAN DIO-NASH小鼠主要表現(xiàn)為門靜脈周圍或竇周纖維化，F(xiàn)1期NASH患者則主要表現(xiàn)為竇周纖維化；而中度纖維化（F2期）的GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者都伴有門靜脈/門靜脈周圍纖維化和竇周纖維化。

圖1. GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者的肝臟組織具有相似的病理學(xué)特征。（圖來(lái)源Ref.2）

肝活檢病理組織學(xué)評(píng)分也表明，25只GAN DIO-NASH小鼠中有22只出現(xiàn)肝纖維化，且?guī)缀醵汲尸F(xiàn)輕度至中度纖維化（表1）。NAFLD活動(dòng)評(píng)分也顯示，NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠具有相似的疾病嚴(yán)重程度（表2）。

表1. NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠肝活檢組織病理學(xué)評(píng)分的比較。（表來(lái)源Ref.2）

表2. NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠NAFLD活性評(píng)分(NAS)的比較。（表來(lái)源Ref.2）

GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者具有重疊的肝轉(zhuǎn)錄組譜

主成分分析（Principal components analysis，PCA）顯示，體重正常的健康人的肝臟轉(zhuǎn)錄組譜能與NASH患者的轉(zhuǎn)錄組譜清楚地分開(kāi)，在小鼠中結(jié)果一樣（圖2A）。

而且在GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者的肝臟活檢中發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)基因 (differentially expressed genes，DEGs)，且這些DEGs有著顯著重疊（圖2B）?；蚣患治觯╣ene set enrichment analysis, GSEA）顯示，這些基因主要與營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫功能和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix ，ECM）組織結(jié)構(gòu)有關(guān)（圖2C）。

圖2. NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠的肝臟轉(zhuǎn)錄組變化。（圖來(lái)源Ref.2）

為了進(jìn)一步探究GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者中肝臟轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控，研究者們對(duì)與NASH病理學(xué)和纖維化相關(guān)基因的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，與NASH患者相比，GAN DIO-NASH小鼠在七個(gè)既定基因組別中展現(xiàn)出葡萄糖代謝不足、脂質(zhì)和膽汁酸處理受損、免疫調(diào)節(jié)受損、內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 應(yīng)激、肝細(xì)胞損傷和ECM重塑活動(dòng)的增強(qiáng)（圖3A）。另外，通過(guò)分析28個(gè)編碼NASH藥物靶點(diǎn)的基因，研究者們發(fā)現(xiàn)它們可被歸為3大類：脂質(zhì)和葡萄糖代謝、炎癥，以及ECM組織結(jié)構(gòu)（圖3B），且絕大部分基因在GAN DIO-NASH小鼠中都受到了明顯的調(diào)控。

圖3. NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠中對(duì)疾病相關(guān)候選基因的調(diào)控。（圖來(lái)源Ref.2）

GAN DIO-NASH小鼠表現(xiàn)出糖耐量受損

與普通飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組小鼠相比，在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，GAN DIO-NASH小鼠體重明顯增加、全身脂肪量增加（肥胖），并出現(xiàn)肝腫大（圖 4A-4D），糖耐量（glucose tolerance）受損（圖 4E），高胰島素血癥（hyperinsulinemia）以及HOMA-IR 指數(shù)增加（圖 4F-G），還伴隨著高瘦素血癥和高膽固醇血癥（圖4H-I）。此外，雖然GAN DIO-NASH小鼠血漿游離脂肪酸水平有顯著升高（p = 0.05），但其血漿TG濃度并無(wú)顯著變化（p = 0.75）（圖4J-K） 。

圖4. GAN DIO-NASH小鼠具有代謝綜合征的特性。（圖來(lái)源Ref.2）

GAN DIO-NASH小鼠血漿和肝臟的生化變化

對(duì)其他血漿和肝臟生化參數(shù)的分析結(jié)果顯示，與普通飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組小鼠相比，GAN DIO-NASH小鼠血漿中肝臟受損的標(biāo)志物（ALT、AST）和纖維化的標(biāo)志物 (total CK18、MMP-9、TIMP-1）水平均有顯著升高，肝臟TG、TC和HP的濃度也有顯著增長(zhǎng)，但肝臟MMP-9的水平并沒(méi)有顯著增加（表3）。

表3. GAN DIO-NASH小鼠中血漿和肝臟的生化變化。（表來(lái)源Ref.2）

GAN DIO-NASH小鼠的血漿和肝臟中的細(xì)胞因子/趨化因子水平升高

對(duì)血漿和肝臟中的細(xì)胞因子/趨化因子水平的分析結(jié)果顯示，與普通飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組小鼠相比，GAN DIO-NASH小鼠血漿和肝臟中的TNF-α、KC/GRO和MCP-1濃度均有顯著增長(zhǎng)，特別是肝臟MCP-1。另外，GAN DIO-NASH小鼠血漿IL-6和IL-10，以及肝臟IL-1β和IL-5的濃度也有顯著提高。

表4. GAN DIO-NASH小鼠血漿和肝臟中的細(xì)胞因子/趨化因子水平升高。（表來(lái)源Ref.2）

小結(jié)

綜上，GAN DIO-NASH小鼠在生理、代謝和組織病理學(xué)方面都具有良好的臨床轉(zhuǎn)化性，可用于NASH發(fā)病機(jī)制的探索、潛在治療靶點(diǎn)的確定，以及新藥的研發(fā)。雖然可供選擇的治療靶點(diǎn)數(shù)目不少，在研藥物也不少（表5），但還沒(méi)有任何NASH藥物獲批。目前，奧貝膽酸（obeticholic acid，OCA）是唯一一個(gè)在關(guān)鍵3期臨床試驗(yàn)中獲得積極結(jié)果的藥物。然而，在最近的試驗(yàn)中，OCA單一療法只能使不到三分之一的患者獲得NASH消退，因此，有研究者認(rèn)為未來(lái)NASH的治療還是需要依靠聯(lián)合療法[3]。

表5. NASH藥物臨床試驗(yàn)信息（表來(lái)源Ref.4）