國際共識的細胞衰老標志物及檢測方法，你get到了嗎？

小夢想在努力 2021-07-28

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1961年，美國生物學(xué)家 Leonard Hayflick在體外培養(yǎng)正常人成纖維細胞時，發(fā)現(xiàn)一個奇怪的現(xiàn)象——即使給予最適宜的生長條件，細胞依舊不能無限制地進行增殖；在分裂至一定代數(shù)時，細胞周期似乎進入了一種“不可逆”的停滯狀態(tài)，細胞不再分裂并最終走向死亡。

基于此種現(xiàn)象，Hayflick首次提出了細胞衰老（cellular senescence）概念；這種細胞增殖能力的極限，則被命名為Hayflick極限（Hayflick limit）。

我們都知道，細胞是機體生命活動的基本單元，細胞衰老和個體衰老之間有著密切的關(guān)系。因此自細胞衰老概念問世以來，數(shù)不清的科學(xué)工作者投身于該領(lǐng)域，以期從細胞衰老層面獲取破解個體衰老奧秘的鑰匙。

然而由于實驗條件等因素的不同，研究人員對于細胞衰老的定義甚至都存在著差異。

為推進細胞衰老領(lǐng)域快速發(fā)展，2019年，來自多個國家的細胞研究人員所成立的“國際細胞衰老學(xué)會”（International Cell Senescence Association, ICSA）就細胞衰老的特征與生物標志物達成共識，并在國際著名期刊《Cell》上發(fā)表題為“Cellular Senescence: Defining a Path Forward”的文章。

（原文鏈接：https:///10.1016/j.cell.2019.10.005）

該文章明確規(guī)范了細胞衰老的定義、特征以及推薦檢測方法。這里小P與大家一起學(xué)習(xí)一下~

一

細胞衰老的定義及特征

細胞衰老是一種由壓力信號刺激產(chǎn)生，存在于特定生理過程的細胞狀態(tài)?？捎筛鞣N不同的細胞應(yīng)激出發(fā)，如DNA損傷、癌基因激活、氧化應(yīng)激或外源性毒物暴露等。細胞衰老不等同于細胞死亡，衰老的細胞在一段時間內(nèi)仍保持代謝活性，也會出現(xiàn)一些明顯的變化，具有典型的細胞周期停滯、衰老相關(guān)分泌表型、大分子損傷及代謝紊亂四個特征。

（圖片源于參考文章）

1. 細胞周期停滯

細胞衰老最基本的特征之一，就是細胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的細胞周期停滯，可能是由有害刺激或異常增殖引起的警報反應(yīng)。該現(xiàn)象是在體外鑒定細胞衰老最基本也是最不可或缺的指標之一。

2. 衰老相關(guān)分泌表型

衰老細胞會分泌大量的因子（見下表），包括促炎細胞因子和趨化因子、生長調(diào)節(jié)劑、血管生成因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，統(tǒng)稱為衰老相關(guān)分泌表型（Senescent Associated Secretory Phenotype, SASP）。SASP是衰老細胞的另一個典型標志之一，它介導(dǎo)了許多衰老細胞的病理生理效應(yīng)，促進細胞與周圍環(huán)境的交流，最終影響衰老細胞的命運。

（圖片源于參考文章）

3. 大分子損傷

（1）DNA損傷。細胞衰老所體現(xiàn)出的第一個分子表征是端粒縮短，端粒長度隨著細胞增殖逐漸縮短，導(dǎo)致端粒DNA環(huán)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性喪失以致端粒結(jié)構(gòu)破壞，激活DNA損傷應(yīng)答，最終阻滯細胞周期。此外其他通過誘導(dǎo)不可修復(fù)的DNA損傷來也可以導(dǎo)致細胞衰老。

（2）蛋白質(zhì)損傷。蛋白毒性是個體衰老和細胞衰老的標志，因此蛋白質(zhì)損傷有助于識別衰老細胞。ROS是蛋白質(zhì)損傷的一個重要來源，它能氧化蛋氨酸和半胱氨酸殘基，改變蛋白質(zhì)的折疊和功能。同時，被ROS羰基化的氨基酸殘基可與氨基反應(yīng)形成希夫堿促進蛋白聚集，隨后與糖和脂類交聯(lián)形成脂褐素。

（3）脂質(zhì)損傷。脂質(zhì)對于細胞膜的完整性、能量的產(chǎn)生和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)都是必不可少的。一些與衰老相關(guān)疾病會影響脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。然而由于衰老相關(guān)脂質(zhì)譜的高度變異性，脂質(zhì)指標作為衰老生物標志物的應(yīng)用十分受限。

4. 代謝紊亂

衰老細胞中的線粒體功能減弱，ATP生成受阻，同時還會產(chǎn)生大量的ROS，造成蛋白質(zhì)損傷和脂質(zhì)損傷。

衰老細胞中的溶酶體數(shù)量和大小均有增加，逐漸增多累積的功能失調(diào)的溶酶體可能會試圖使細胞通過產(chǎn)生更多的新溶酶體來平衡，以期完成細胞能量不足或廢物降解增多需求，此外衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）會在溶酶體積累。

二

細胞衰老的生物標志物

1. 衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）。SA-β-gal在正常人體細胞主要表達在溶酶體，最適pH是4-4.5；而在衰老細胞中，SA-β-gal不僅大量積累，最適pH還偏移至6，因此人為給予β-gal作用底物X-gal和pH6的環(huán)境，衰老細胞可以在β-gal的作用下，將底物轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{色，使得發(fā)生衰老的細胞在普通光學(xué)顯微鏡下即可觀察到。

2. 脂褐素。脂褐素可使用生物素蘇丹黑B（Sudan Black B, SBB）模擬物（GL13）標記，可以通過光學(xué)顯微鏡或組織化學(xué)方法在溶酶體中觀察到，是衰老細胞檢測常用的一種指標。

3. 細胞周期相關(guān)因子p16、p21、p53、RB、Ki67。RB和p53蛋白對于衰老細胞周期停滯至關(guān)重要。CDK2的抑制因子p21和CDK4/6的抑制因子p16會在衰老細胞中發(fā)生積累，這種積累促使RB家族蛋白持續(xù)活化，抑制E2F的反式激活，從而導(dǎo)致無法逆轉(zhuǎn)的細胞周期停滯。Ki67是一種胞核蛋白，也是一種頻繁使用的細胞增殖標志物。

4. 衰老相關(guān)分泌表型（SASP）。衰老細胞分泌的相關(guān)因子如IL-6、IL-8、IL-1、VEGF和MMP等也可作為細胞衰老的生物標志物。

5. 核纖層蛋白B1（Lamin B1）。核纖層主要成分層核纖層蛋白B1的下調(diào)是細胞衰老的另一個重要特征。核纖層蛋白B1的丟失與表觀遺傳學(xué)特征以及與衰老相關(guān)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

三

細胞衰老的檢測方法

在體內(nèi)，由于衰老細胞存在于各種組織中。不同組織的狀態(tài)、細胞衰老類型都有所區(qū)別，所以目前還沒有針對衰老細胞的絕對特異性的單一標志物。

標記的特異性因細胞類型，組織，機體發(fā)育階段，物種和其他因素而異。但是，一些標記具有更普遍的有效性，而另一些則與特定的衰老類型有關(guān)。因此，該文章中建議使用以下的多標記方法，確保能更準確地在原位檢測衰老細胞：