2021年7月12日/醫(yī)麥客新聞 eMedClub News/--最近幾年，腫瘤免疫細(xì)胞療法發(fā)展迅速，尤其是CAR-T細(xì)胞，已經(jīng)有五款CAR-T細(xì)胞療法產(chǎn)品獲得美國FDA批準(zhǔn)上市。國內(nèi)也迎來了第一款CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的上市。

NK細(xì)胞的安全性及其抗腫瘤潛力，使它們成為實(shí)施CAR技術(shù)的有希望的細(xì)胞類型，可將其細(xì)胞毒性潛力重定向至特定靶標(biāo)。目前，CAR-NK細(xì)胞的免疫療法研究成為越來越多研究者的選擇方向。

▲ NK細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性機(jī)制

NK細(xì)胞來源非常廣泛，比如外周血、臍帶血、胚胎干細(xì)胞、人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和NK細(xì)胞系，不同來源的NK細(xì)胞有著各自的優(yōu)勢和缺陷。由于NK細(xì)胞可以經(jīng)歷的細(xì)胞分裂數(shù)量有限，很難擴(kuò)增為輸注所需的大量細(xì)胞。因此，研究者們逐步使用NK細(xì)胞系（如NK-92、YTS、KHYG-1等）代替從臍帶或外周血獲得的原代NK細(xì)胞進(jìn)行了研究。

在血液系統(tǒng)腫瘤中，目前研究較多的為CD19-CAR-NK細(xì)胞和CD33-CAR-NK細(xì)胞。

▲ CAR-NK細(xì)胞在血液瘤中的臨床前研究

1.急性白血病

CAR-T細(xì)胞治療急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）已顯示出顯著臨床療效，但該療法對急性髓系白血?。ˋML）療效不佳。從理論上講，CAR-NK細(xì)胞比CAR-T細(xì)胞具有更有利的毒性，特別是在避免CRS等副作用方面。然而，這方面的臨床數(shù)據(jù)尚無報(bào)道。

Xiaowen Tang等評估了CD33-CAR-NK細(xì)胞在復(fù)發(fā)和難治性AML患者中的安全性。該研究共入組3例患者，采用第二代CAR，結(jié)果顯示在5x109個(gè)細(xì)胞的輸注劑量下，沒有明顯的不良反應(yīng)，并且與CAR-T細(xì)胞相比，CAR-NK-92細(xì)胞的成本生產(chǎn)更低，相信經(jīng)過優(yōu)化后將被廣泛用于治療腫瘤。

2.淋巴瘤

MD安德森腫瘤中心I/IIa期試驗(yàn)的結(jié)果顯示，以CD19為靶點(diǎn)的臍帶血來源的CAR-NK細(xì)胞療法，在復(fù)發(fā)性/難治性非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者和慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）患者中顯現(xiàn)出臨床療效，而且未觀察到嚴(yán)重毒性反應(yīng)。

該研究共入組11例患者，其中5例CLL患者，6例NHL患者，所有患者均接受最少3線和最多11線的先前治療。8例患者（73%）獲得緩解，其中7例（4例淋巴瘤，3例CLL）完全緩解，1例Richter’s轉(zhuǎn)化成分緩解，但有持續(xù)性CLL。

在注射后30天內(nèi)，所有劑量水平的反應(yīng)都很迅速，注入的CAR-NK細(xì)胞擴(kuò)增并維持在低水平至少12個(gè)月。另外，研究結(jié)果表明，CAR-NK細(xì)胞的使用與CRS、神經(jīng)毒性或GVHD的發(fā)生無關(guān)，炎癥細(xì)胞因子（包括IL-6）的水平也沒有增加。

Fate Therapeutics公司近期公布異體iPSC衍生的CAR-NK細(xì)胞FT596的臨床數(shù)據(jù)，F(xiàn)T596單藥治療表現(xiàn)出持久的腫瘤清除能力和延長的體內(nèi)存活率，顯示出iPSC衍生的NK細(xì)胞療法成為新型癌癥免疫療法的開發(fā)前景。

此外，F(xiàn)T596在與利妥昔單抗聯(lián)用時(shí)，與單獨(dú)使用利妥昔單抗相比，F(xiàn)T596在體內(nèi)顯示出對CD20+淋巴瘤細(xì)胞殺傷的增強(qiáng)。這初步顯示出，抗體藥物與NK細(xì)胞治療聯(lián)合應(yīng)用可以發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，將會是CAR-NK細(xì)胞又一個(gè)開發(fā)新方向。

3.多發(fā)性骨髓瘤（MM）

MM是在B淋巴細(xì)胞分化成漿細(xì)胞的過程中發(fā)生的遺傳突變導(dǎo)致的惡性腫瘤。MM細(xì)胞系中常見的腫瘤抗原有CS1、CD138、BCMA等。關(guān)于CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品治療MM的研究相對較少。目前用于治療MM的CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品多采用NK92細(xì)胞系，所采用的腫瘤抗原多為CS1和CD138。

細(xì)胞表面糖蛋白CD2子集1（CS1）是MM細(xì)胞表面高度表達(dá)的蛋白質(zhì)，多參與MM細(xì)胞黏附和生長。CD138參與MM細(xì)胞的黏附、生長和成熟，是MM主要的診斷標(biāo)記。體外研究已經(jīng)證實(shí)，分別利用CS1和CD138為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的CS1-CAR-NK92細(xì)胞和CD138-IFNα-CAR-NK92細(xì)胞成功抑制MM細(xì)胞生長，延長了骨髓瘤小鼠的存活期。

CAR-NK用于治療實(shí)體瘤的研究

CAR-T細(xì)胞在抗擊實(shí)體腫瘤的過程中，會出現(xiàn)PD-1/PD-L1介導(dǎo)的免疫抑制。NK細(xì)胞表面PD-1表達(dá)很低，相對受腫瘤微環(huán)境免疫抑制小，也許是抗擊實(shí)體瘤的良好候選者。

在實(shí)體瘤研究中，CAR-NK細(xì)胞的研究靶點(diǎn)多是靶向表達(dá)HER2、PSMA、mesothelin、ROBO1或MUC1等腫瘤相關(guān)抗原的轉(zhuǎn)移性實(shí)體惡性腫瘤，例如前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌和非小細(xì)胞肺癌。

▲ CAR-NK細(xì)胞在實(shí)體中的瘤臨床前研究

目前，CAR-NK針對實(shí)體瘤的治療逐漸展開。

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NK細(xì)胞對基因工程的抗性挑戰(zhàn)

病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)

從歷史上看，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒對原代NK細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率均較差。基于γ逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體需要細(xì)胞積極增殖才能進(jìn)入細(xì)胞。慢病毒的載體既可以感染循環(huán)細(xì)胞也可以感染非循環(huán)細(xì)胞，并攜帶較大的轉(zhuǎn)基因，但由于其生存能力往往受到負(fù)面影響，因此它們在原代NK細(xì)胞中的效率也受到限制。

電穿孔

基因工程N(yùn)K細(xì)胞的一種非病毒策略是通過DNA或mRNA質(zhì)粒的電穿孔。DNA的電穿孔效率很低，且無法在DNA中穩(wěn)定整合構(gòu)建體。

轉(zhuǎn)座子

目前正在研究的非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種替代方法是使用轉(zhuǎn)座子。最常用的兩種主要方法——piggyBac和睡美人(SB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，目前正在臨床測試基于SB的CAR載體。

SB最初來源于魚類，但在人類基因組中仍保留其活性。它由兩個(gè)部分組成：介導(dǎo)剪切和粘貼的SB轉(zhuǎn)座酶和側(cè)翼為末端反向重復(fù)序列(TIR)的DNA載體，轉(zhuǎn)座酶可以與之結(jié)合以介導(dǎo)其幾乎隨機(jī)整合到基因組中。

這種方法可以轉(zhuǎn)導(dǎo)長度大于100kb的基因，使其成為CAR整合的一個(gè)有吸引力的更高效率選擇。轉(zhuǎn)座子工程化的CAR-NK細(xì)胞是一種有前途的替代方法，可以在沒有病毒整合的情況下實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。

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CRISPR/Cas9

先前討論的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法依賴于載體整合，而沒有指定整合位點(diǎn)。必需存活基因或腫瘤抑制基因的整合和隨后破壞的可能性對于臨床產(chǎn)品可能是有害和危險(xiǎn)的。與轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)或鋅指核酸酶(ZFN)等類似方法相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)開啟了高效靶向基因整合的可能性。

解決NK細(xì)胞的增殖潛力有限的挑戰(zhàn)

1.基于細(xì)胞因子的擴(kuò)增

基于細(xì)胞因子的擴(kuò)增方案通常依賴于超生理水平來誘導(dǎo)原代NK細(xì)胞的擴(kuò)增。

2、基于飼養(yǎng)層的擴(kuò)增

基于飼養(yǎng)層的擴(kuò)增方案將來自飼養(yǎng)層系統(tǒng)的受體介導(dǎo)的輸入與細(xì)胞因子支持相結(jié)合，以促進(jìn)原代NK細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增。

解決NK體內(nèi)擴(kuò)增的挑戰(zhàn)

來自過繼細(xì)胞療法(ACT)臨床試驗(yàn)的證據(jù)通常無法在輸注后1-2周內(nèi)檢測到輸注NK細(xì)胞的存在。雖然NK細(xì)胞的短壽命有助于它們在ACT環(huán)境中的安全性，但它也顯著縮小了治療窗口。

目前，全球正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)進(jìn)行的薈萃分析確定了520項(xiàng)有效試驗(yàn)，共檢查了64種不同的CAR，其中96.4％的試驗(yàn)使用CAR-T細(xì)胞。因此，就將實(shí)驗(yàn)室研究轉(zhuǎn)化為臨床環(huán)境而言，CAR-NK細(xì)胞領(lǐng)域仍處于起步階段。

▲ CAR-NK細(xì)胞在血液瘤和實(shí)體瘤中的臨床研究

隨著CAR-NK細(xì)胞療法的臨床價(jià)值凸顯，不管是賽諾菲、百時(shí)美施貴寶等制藥巨頭還是Catamaran Bio、Artiva Bio等生物技術(shù)初創(chuàng)公司都相繼布局CAR-NK賽道。顯而易見，CAR-NK已成為繼CAR-T之后最引人關(guān)注的工程細(xì)胞療法。

近些年隨著對NK的細(xì)胞生物學(xué)，免疫學(xué)，以及記憶性NK細(xì)胞的研究和認(rèn)識越來越深入以及對于NK細(xì)胞的免疫相關(guān)受體的信號通路等新的研究.。越來越多的研究為NK細(xì)胞在免疫治療中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)，相信隨著理論知識的更加完善，臨床研究的進(jìn)行，以及對當(dāng)前CAR-NK細(xì)胞面臨挑戰(zhàn)的攻克，CAR-NK細(xì)胞療法也許會為腫瘤免疫治療帶來革命性進(jìn)展，CAR-NK細(xì)胞的治療方法在今后也能占據(jù)一方舞臺。

參考資料：

1.https://mp.weixin.qq.com/s/a8PZZLfWYf684aH4BfkVUQ

2.https://mp.weixin.qq.com/s/nLKPgREeE3jLJ4O9XxQQEw