解螺旋公眾號·陪伴你科研的第2569天

各位小伙伴大家好，今天給大家?guī)淼氖且黄l(fā)表在Medical science monitor（目前最新影響因子：1.9）的GEO數(shù)據(jù)庫的非腫瘤生信文章套路。

Key Genes Associated with Non-Alcoholic Fatty Liver Disease and Acute Myocardial Infarction

在前面的復(fù)現(xiàn)中，我們復(fù)現(xiàn)過了腫瘤單基因套路的文章、基因家族套路的文章、多腫瘤聯(lián)合分析的文章，這次我們來一起看一下多疾病聯(lián)合分析。給你的生信研究多一個切入點。接下來我們看下，在非腫瘤中，又有哪些內(nèi)容呢？

在進(jìn)行這篇文章的復(fù)現(xiàn)之前，我們首先看一下這篇文章的Fig4。

作者在Fig4放了一張全文的流程圖，其實現(xiàn)在在生信文章中放流程圖已經(jīng)很常見了，但是大家一般都放在第一張圖。第四張圖是流程圖還是一個很有創(chuàng)意的操作。不管怎么說，放流程圖這一點還是值得我們大家學(xué)習(xí)的，我們也借助這張圖看一下作者的分析思路：

首先，作者分別在NAFLD（非酒精性脂肪肝）的GSE63067數(shù)據(jù)集和AMI（急性心肌梗死）的GSE60993和GSE66360數(shù)據(jù)集（這個位置作者在流程圖中寫錯了，大家要引以為戒）中，分別篩選了差異基因后取交集，這也就是我們“挑”這部分，然后對交集基因進(jìn)行了GO/KEGG富集分析（圈），之后繪制了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（聯(lián)），最后，對于Hub基因，作者又在兩個疾病中分別繪制了ROC曲線（靠）。

接下來我們來看一下各張圖片：

目前仙桃學(xué)術(shù)已經(jīng)收錄了部分GEO數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集，現(xiàn)在我們就登陸仙桃學(xué)術(shù)進(jìn)行實操一下如何復(fù)現(xiàn)這張熱圖吧。

登陸仙桃學(xué)術(shù)：www.

選擇“數(shù)據(jù)集檢索”——在檢索框中輸入我們本文中所應(yīng)用的非酒精性脂肪肝數(shù)據(jù)集GSE63067，回車之后即可看到數(shù)據(jù)集的基本情況。

下拉該界面，點擊“選擇樣本”，可以看到該數(shù)據(jù)庫中共有18個樣本，點擊序號左側(cè)的小方框即可選擇全部樣本，在備注中輸入“非酒精性脂肪肝”（不寫也可以，但是因為本文用到了幾個GEO數(shù)據(jù)集，建議大家逐個做好標(biāo)注），最后點擊“添加到樣本庫”，我們的第一個數(shù)據(jù)集的樣本就添加好啦。

在添加之后，界面會顯示“添加成功!”字樣，我們可以看到左側(cè)樣本庫信息中已經(jīng)顯示了我們剛剛加入的樣本，現(xiàn)在點擊“進(jìn)入我的樣本庫”。

作者在原文中描述該數(shù)據(jù)集中有11個NAFLD樣本與7個正常對照，我們先選擇正常的7個樣本，加入分組1中，作為對照組。并用同樣方法將其余的11個樣本加入分組2中。

現(xiàn)在我們可以看到兩個分組均已選擇好，點擊右側(cè)的“提交分析”。

免費版/基礎(chǔ)版/高級版每日可以提交分析的次數(shù)是不同的，高級版的20次一般足夠大家日常分析所需啦~

一般幾分鐘后我們就可以在頁面下方看到歷史記錄中狀態(tài)變成完成啦，在這里我們修改一下項目名稱為“差異分析-GSE63067”，點擊確定。

接下來我們用同樣的方法分析急性心肌梗死的GSE66360數(shù)據(jù)集，原文中，作者應(yīng)用了GSE66360和GSE60993兩個數(shù)據(jù)集綜合分析，目前GSE60993數(shù)據(jù)集仙桃學(xué)術(shù)尚未收錄，在這里我們僅以GSE66360這一個數(shù)據(jù)集進(jìn)行示范：

根據(jù)GEO數(shù)據(jù)庫對該數(shù)據(jù)集的描述，該數(shù)據(jù)集中收錄了50例正常對照及49例心肌梗死后患者樣本，我們?nèi)匀粚⒄φ赵O(shè)置為分組1。

接下來我們進(jìn)入生信工具的“歷史記錄”模塊，在這里我們可以看到剛剛分析完成的兩個數(shù)據(jù)集：

點擊“下載”，即可看到“熱圖下載”選項，點擊即可下載保存：

同樣方法也可以得到另一個數(shù)據(jù)集的熱圖結(jié)果，大家自己試著做一下，我就不多贅述啦。

首先我們下載NAFLD的GSE63067數(shù)據(jù)集分析結(jié)果，在EXCEL中打開，應(yīng)用篩選功能，根據(jù)原文設(shè)置篩選條件為：|logFC|>1且p<0.05。

注：通常情況下，我們一般通過設(shè)置adj.P閾值進(jìn)行篩選，但是在小編復(fù)現(xiàn)時候，發(fā)現(xiàn)如果設(shè)置adj.P的話，得到的差異基因結(jié)果較少，因此，我們在這里以p<0.05為閾值進(jìn)行后續(xù)的復(fù)現(xiàn)。

新建一個EXCEL表格，命名為“韋恩圖”，并將上述篩選得到的基因名稱復(fù)制粘貼到第一列。

用同樣方法粘貼AMI的GSE66360數(shù)據(jù)集篩選結(jié)果，最后得到的結(jié)果如下：

保存該文件。

接下來我們利用我們的仙桃學(xué)術(shù)進(jìn)行可視化。

進(jìn)入生信工具，選擇“基礎(chǔ)繪圖”——“韋恩圖”模塊，點擊上傳文件，上傳我們剛剛整理好的結(jié)果，之后點擊確認(rèn)。

仙桃學(xué)術(shù)提供了結(jié)果的幾種保存形式，可以按照自己的需要進(jìn)行保存。

由于我們下一步還要對差異基因進(jìn)行富集分析，在這里，我們還需要下載一下Excel格式表格。

打開我們上一步得到的結(jié)果文件：

選擇交集這一列，新建一個文檔進(jìn)行保存。

打開生信工具，選擇“功能聚類（圈）”——“GO|KEGG”——“GO|KEGG富集分析”模塊，上傳我們剛剛整理好的文檔，在右側(cè)富集分析中我們先選擇GO：BP（也就是我們的Fig5），最后點擊確認(rèn)。

得到富集分析結(jié)果如下：

點擊保存結(jié)果，保存結(jié)果名稱為GO_BP。

修改富集分析參數(shù)位置的條目，我們可以依次得到GO_BP、GO_CC、GO_MF和KEGG的結(jié)果。

進(jìn)入“GO|KEGG可視化”模塊，就可以看到我們之前保存的結(jié)果啦。在這里我們?nèi)匀灰訥O_BP結(jié)果為例進(jìn)行示范：

我們選擇GO_BP項目，其它參數(shù)暫時選擇默認(rèn)，輸出結(jié)果如下：

我們可以看到目前結(jié)果和原文中的橫縱坐標(biāo)是相反的，我們可以在參數(shù)中進(jìn)行調(diào)整：

調(diào)整后結(jié)果如下：

點擊保存結(jié)果，我們將此結(jié)果保存。

用同樣方法輸出GO_CC、GO_MF以及KEGG的富集結(jié)果，分別保存。結(jié)果如下：

之后我們來看一下如何進(jìn)行拼圖：

雖然本文用了四張圖片依次展示了結(jié)果，但是大部分時候更常見的是將多張小圖拼成一個大圖，所以拼圖這一項技能我們也要加滿喲。

點擊上方“拼圖工具”，就可以看到我們之前保存的四張圖片啦。

將圖片拖進(jìn)來，然后調(diào)整到自己想要的位置及大小即可：

工具目前還提供了自動吸附、輔助線等功能輔助我們進(jìn)行拼圖，可以進(jìn)行少許留白，最后點擊“PDF下載”就可以看到拼完的圖片了，字母工具也替我們加上啦。這張一張風(fēng)格統(tǒng)一、對齊又美觀的圖片就完成啦。

我們本次分析得到的結(jié)果和原文并不一致，因為我們所用的數(shù)據(jù)集較原文少了一個，但是文章的分析和操作思路還是一樣的，還是可以供大家參考學(xué)習(xí)我們的生信工具都可以做些什么。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)我們需要借助String數(shù)據(jù)庫，有持續(xù)關(guān)注我們推文復(fù)現(xiàn)的小伙伴們一定對于這個數(shù)據(jù)庫已經(jīng)不陌生啦。

登入String數(shù)據(jù)庫：https:///

數(shù)據(jù)庫的主界面長這樣：

點擊“SEARCH”即可進(jìn)入分析界面。選擇“Multiple proteins”，將之前得到的交集基因輸入分子列表中，確定物種：人類，點擊SEARCH。

得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。如果覺得得到的分子過多或過少可以點擊右下角的“More”和“Less”進(jìn)行調(diào)整。

在“Exports”模塊中可以輸出上面的圖片。

也可以保存TSV格式的結(jié)果“string_interactions.tsv”文件，然后在cytoscape軟件中進(jìn)一步美化：

打開cytoscape軟件，在左上角菜單欄File-Import-Network from File，導(dǎo)入我們剛剛下載的“string_interactions.tsv”文件。

點擊“OK”即可導(dǎo)入。

生成基本圖像：

想形成文章中所示的圓形的話，在Layout中點擊Circular Layout，就形成圓形啦。

用Excel打開我們之前在String數(shù)據(jù)庫下載的tsv格式結(jié)果：

統(tǒng)計node1中，每個蛋白的個數(shù)：

打開Excel中的篩選功能，先選擇第一個蛋白，點擊確定。

表格左下角會顯示該蛋白出現(xiàn)的次數(shù)：

依次進(jìn)行整理，最后結(jié)果如下圖所示：

按照節(jié)點個數(shù)降序排列。

選擇“插入”——“圖表”——“二維柱形圖”：

得到結(jié)果：

本文的最后兩張圖，作者展示了在前面分析得到的TOP6基因在兩種疾病中的診斷效能，我們一起來看一下：

我們以我們在復(fù)現(xiàn)過程中得到的前四個分子為例（FPR1、BCL2A1、MMP9、MNDA），在AMI的GSE66360數(shù)據(jù)集中進(jìn)行分析。

首先，我們下載GSE66360的表達(dá)譜數(shù)據(jù)：

用Excel打開：

新建一個文件，在表達(dá)譜文件中搜索“FPR1”，復(fù)制整行，并轉(zhuǎn)置到空白文件中，將四個基因表達(dá)譜整理如下：

在“結(jié)果報告下載”下載得到的壓縮包中，解壓后找到“樣本表格”文件，打開，如下圖所示：

整理表達(dá)數(shù)據(jù)及樣本表格中的分組結(jié)果，最后整理結(jié)果如下圖所示：

在仙桃工具中，“基礎(chǔ)繪圖”——“診斷性ROC曲線”模塊，上傳我們剛剛整理好的文件，點擊確認(rèn)。

就可以看到圖11的結(jié)果啦：

下拉即可看見的AUC結(jié)果表：

同時也提供了詳細(xì)的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果描述供大家參考，感興趣的話大家也可以自行查看~

好啦，到此為止，這篇文章我們就復(fù)現(xiàn)結(jié)束了，感覺這篇文章的新意在于將兩個非腫瘤疾病進(jìn)行了聯(lián)合分析，不知道是不是也能給大家?guī)硇碌乃悸泛蛦l(fā)呢？

撰文丨銀杏

排版丨豨薟

醫(yī)學(xué)人體解剖手繪：科學(xué)與藝術(shù)交織的生命真實

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本周直播預(yù)告

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直播主題：醫(yī)生做科研的最佳路徑

直播時間：5月22日晚18點-20點