（濤濤醬：是不是很香很好用！） （黑衣人：沒錯?。。ㄌ蚩谒?ˉ﹃ˉ) ） 那么體驗過非腫瘤類GEO數(shù)據(jù)集的文章，那么怎么能不領教一下仙桃在腫瘤類GEO數(shù)據(jù)集的快感呢！ 所以今天我們無代碼復現(xiàn)一篇2021年2月IF為3.337分發(fā)表在OncoTargets and Therapy的一篇使用GEO分析腫瘤生信類型文章。
期刊簡介
實驗與方法 一篇文章，“材料與方法”部分是文章的靈魂所在，那下面我們來看看在“材料和方法”部分，作者闡明了實現(xiàn)本文用了哪些生信手段。 為了避免大家看太多的字，那我就總結一下吧！ （黑衣人：哇喔 濤濤醬什么時候變得那么nice了！） 疾?。?/span>肝細胞癌 數(shù)據(jù)：GEO數(shù)據(jù)集（三個數(shù)據(jù)集） TCGA 實現(xiàn)手段：篩選差異基因（R語言之limma包） 功能聚類（GO、KEGG、DO、Reactome） 互作網(wǎng)絡（蛋白—蛋白交互PPI） 關鍵基因分析（CTD數(shù)據(jù)庫） （黑衣人：Emm，那我們要做哪些圖呢？） （濤濤醬：欲知詳情，客官兒下邊請！） 由于我們今天是GEO專場，篇幅有限，我們之前復現(xiàn)了很多次的TCGA相關內容此次就先不贅述。 復現(xiàn)任務 那么接下來我們一起來看一下本次的復現(xiàn)任務。
圖1：差異基因表達
圖2：富集分析
圖3. 蛋白互作網(wǎng)絡
圖4. CCNA2, CCNB1, CDC20, CDK1, PTTG1, and TTK 的相關性
圖5. 驗證基因的表達情況
圖6. 驗證基因的免疫組化情況
圖7 Cox回歸森林圖
圖8. 生存曲線圖 （黑衣人：哇！果然是圖種很豐富的一篇文章欸！） （濤濤醬：是吧！所以趕緊一起來看看仙桃GEO復現(xiàn)吧！） 數(shù)據(jù)來源 & 思路框架 1
復現(xiàn)步驟： 進入仙桃學術工具（https://www.）；
打開的界面如下：
我們知道，這篇文章涉及了五個數(shù)據(jù)集，分別為GSE45267, GSE84402和GSE101685。 那我們就一個一個來添加我們的數(shù)據(jù)集。 首先選擇數(shù)據(jù)集GSE45267。
輸入后，選擇“選擇樣本”按鈕。 點開這個“選擇樣本”，就能選擇對應數(shù)據(jù)集的樣本。 我們把所有的組織都勾選上，最后點選“添加到樣本庫”即可。 小貼士： 由于樣本太多，容易混淆腫瘤組與正常組，所以建議在此分兩次進行添加。 （黑衣人：好的！思路很清晰，那我就開始添加啦！） （濤濤醬：少俠且慢?。?！此處有一個bug） （黑衣人：驚?。?！發(fā)生了什么事！） 大家可以看一下這個數(shù)據(jù)集，GSE45267。 （濤濤醬：有沒有發(fā)現(xiàn)什么問題？） （黑衣人：咦？納尼？看不出來） 在GSM1100431以及 GSM1100447 這兩個樣本中，出現(xiàn)了前后不一致的情況。
（黑衣人：震驚?。?！仙桃竟然出了這樣的bug！） （濤濤醬：欸？且慢！不要如此草率地下這樣的結論喔！） （黑衣人：蛤？那是哪里出了問題？） （濤濤醬：俗話說得好，遇事不決，可問GEO） 于是我們本著求根溯源地精神，我們要打開源頭GEO看看到底是哪些妖孽在作怪！ GEO的網(wǎng)址在這（https://www.ncbi.nlm./gds）
在其中輸入GSE45267
打開第一個條目 之后眼疾手快地找到原始數(shù)據(jù)
打開more 迅速發(fā)現(xiàn)這兩個可疑的樣本
點開來看看！
（黑衣人：果然?。?！是作者出了問題） （濤濤醬：是的，此處因此產(chǎn)生了歧義） （黑衣人：啊，抱歉，看來是我誤會了我們的仙桃，嗚嗚嗚） （濤濤醬：哈哈哈，終于為仙桃恢復了清白，正身了一次） （黑衣人：啊，那我們該怎么辦呢？） 此處，這兩個樣本有相矛盾的地方。因此無論我們怎么分組，都是可以接受的。 所以我們就暫且把這兩個樣本認為是Tumor組的來示范。 那首先添加腫瘤組數(shù)據(jù)。
鼠標單擊條目即可勾選，把所有的腫瘤組先選中，然后備注Tumor，添加到樣本庫。
接下來，我們進入“進入我的樣本庫” 。 我們將正常組定義為“分組1”；腫瘤組為“分組2”。 所以將這些標記為Tumor的基因勾選中，接著選擇“加入分組2”
同理，回到上一個界面，勾選正常組織，再次添加入樣本庫中，選擇 “加入分組1”。
這樣，我們就完成了第一個數(shù)據(jù)集GSE45267的添加。 值得一提的是，不同權限用戶的樣本庫的上限是不一樣的，普通用戶是20，基礎版用戶是50，高級版用戶是100。后續(xù)還會視情況提高總體上限喔！ 同樣道理，不同權限的用戶每天可以提交分析的次數(shù)也是不同的喔，普通用戶每天只能提交2次分析，基礎版用戶每天可以提交5次分析，高級版用戶每天可以提交20次分析。 所以如果是想分析比較多的數(shù)據(jù)，建議入手高級版喔！ 接下來我們就可以來繪圖了！ 選擇提交分析。
同理添加入剩余2個數(shù)據(jù)集。 這里的權限跟“生信工具”的是一個內容。想要升級權限可以到生信工具頁面進行升級。 點擊提交分析后，下面的歷史記錄中會出現(xiàn)一條分析記錄，點擊右上角的刷新可以刷新分析任務的進度情況。 當分析完成后，就可以下載結果內容了。 一次性提供了很多的結果內容，包括 箱式圖、PCA圖、UMAP圖、火山圖、差異分析結果表格等，以及結果分析報告。
接下來我們就是真正來看看圖1的火山圖如何復現(xiàn)。 點擊“說明”
出現(xiàn)如下界面：
往下卷動鼠標
點擊按鈕即可下載熱圖 （黑衣人：欸？這個怎么和圖中的方向還不太一樣？) （濤濤醬：哈哈，這還不簡單，點擊“細節(jié)修改”進入調整模式）
自動連接到“火山圖”界面
選擇剛剛的樣本 在右側調整參數(shù) 根據(jù)文獻的參數(shù)設置
我們進行相應的參數(shù)調整
點擊確認
就完成了Fig1A的制作。 同樣道理，添加另外兩個數(shù)據(jù)集，也能如法炮制出火山圖來。 接下來我們來看看Fig 1E Venn圖的制作。 此處的目的就是把我們之前不同GEO數(shù)據(jù)集的差異基因取交集。 所以我們就得先獲得差異基因的列表。
比如第一個數(shù)據(jù)集GSE45267,找到剛剛分析的結果，點擊下載按鈕，下載CSV表格。 打開CSV表格
本文是按照表達上調以及表達下調的順序來制定韋恩圖的。 所以我們對logFC的取值進行篩選。
選擇篩選按鈕 選中l(wèi)ogFC這列
點擊小箭頭
即可篩選出logFC大于2 即 表達上調的差異基因。
接著將基因的Gene Symbol 復制貼上到新的excel表格中
將其命名為GSE45267 同理可以得到另外兩列差異基因
將其保存，而后上傳。 路徑：基礎繪圖——分組比較圖——韋恩圖
點擊上傳 讀取數(shù)據(jù)后點擊“確認”
結果就出來啦 （黑衣人：欸？原圖不是有四個數(shù)據(jù)集嗎？） （濤濤醬：你忘了我們這個是GEO專場??！所以我們今天就復現(xiàn)GEO的內容） （黑衣人：喔對對！TCGA往期也都有介紹過了，GEO腫瘤類的今天要專門好好學習一下！） 以上是有關表達上調的Venn圖，同理篩選出logFC<-2的數(shù)值就可以獲得表達下調的Venn圖。 （濤濤醬：那接下來要干嘛呢？） （黑衣人：把這些圖都拼起來?。?/span> 拼圖一如既往采用我們仙桃的拼圖功能喔！仙桃工具拼圖比Illustratior或是Photoshop要節(jié)省不少時間！仙桃工具只要一分鐘，AI或者PS可能要拼至少一天時間。 進入仙桃學術工具（https://www./products）；選擇高級版，點擊“立即使用”（注：免費版和基礎版都可以進行統(tǒng)計和可視化，由于高級版功能最全，這里選擇高級版作為范例）
選擇基礎繪圖 –上傳圖片，點擊進入
此處開始上傳自己的圖片，但是記得圖片要為pdf、tiff、tif、png的格式喔！ 同時也可以調用我們云端的圖片，也就是我們剛剛制作的圖。 比如，剛剛做的火山圖
就可以選擇“保存結果”，保存在云端。 這樣我們打開“拼圖工具”的時候 圖片就自動保存在庫里
拖曳圖片到標尺內
拖曳圖片時候又自動吸附功能以及自動對齊功能 媽媽再也不用擔心我的拼圖了！ 點擊PDF下載，還會自動標記字母哦！點擊下載，即可保存成pdf圖片。 （小貼士：這里也可以把圖稍微放大，或者兩圖直接的行間距放大，可以在右側減少留白） 2 富集分析采用的就是我們剛剛數(shù)據(jù)集取交集的基因來進行。 所以我們首先得獲得剛剛取交集的成功。 這時候，剛剛做Venn圖的優(yōu)勢就直接體現(xiàn)出來了。
下載excel表格，打開
最后一列就是我們取交集的基因 將其復制到新的excel中。 同理可以獲得表達下調的取交集的基因。
全部整合成一列。
打開功能聚類（圈）——GO|KEGG富集分析 然后上傳我們剛剛建立的excel表格 選擇GO條目
然后點擊確認
點擊“保存結果”
而后打開GO|KEGG可視化 選擇剛剛保存的樣本 選擇氣泡圖
點擊確認 就可以出圖啦。
點擊查看大圖
Fig2A是GO的氣泡圖，而Fig2B則是KEGG的氣泡圖。 （黑衣人：我知道，只要把GO的選項改成KEGG就可以咯） 沒錯，還記得剛剛在富集分析的選項里，我們的條目選擇的是GO分析嗎？此處可以更改條目為KEGG。
后續(xù)步驟都相同，即可得到此圖
最后，根據(jù)前面提到的仙桃拼圖功能，即可幾秒鐘拼成一幅Fig 2！ 3 我們借助String來完成這項操作（https://www./）
選擇左側的Multiple proteins 把剛剛做差異表達分析的107個基因 復制到框中
物種選擇Homo sapiens 之后點擊search 就可以呈現(xiàn)和一個宏觀的PPI網(wǎng)絡了！
要想達到Fig 3B的效果，則是需要將結果導出到cytoscape軟件中
緊接著打開cytoscape軟件
就會呈現(xiàn)這個界面
要想形成一個圓形 更改樣式 選擇layout 下拉菜單
即可完成Fig 3 4
圖4. CCNA2, CCNB1, CDC20, CDK1, PTTG1和 TTK 的相關性 希望大家能在腦子里形成一個定式的思維 看到這樣的樓梯狀的圓形圖或者是鐘表圖，就要想到是——相關性熱圖。 （黑衣人：樓梯圓形或樓梯鐘表——相關性熱圖！） 那我們來整理一下思路。 先下載原始數(shù)據(jù)，找出要進行相關性分析的分子，將其的表達數(shù)據(jù)整個提取出來，然后匯總在另外一張表中，再進行相關性分析。 那現(xiàn)在思路清晰了之后，我們就一起來復現(xiàn)吧！ 第一步：下載原始數(shù)據(jù) 原始數(shù)據(jù)是TCGA的，所以我們前往官網(wǎng)下載數(shù)據(jù)。 有兩種方法。 第一種是登入TCGA的網(wǎng)站（https://portal.gdc./） 下載。步驟有些繁瑣，不過熟練的老司機們可以三下五除二搞定。 第二種是登入Xena (https:///datapages/)
往下卷動鼠標 找到 肝癌的部分
點擊進入
點擊下載
而后通過excel打開文件
這時候，我們就要把需要的六個基因給“抓”出來了 可是看到第一列都是Ensemble ID，那怎么辦呢？ 所以我們需要進行ID轉換
緊接著，我們把我們需要抓出來的基因先整理成一份excel表格
保存excel 在方框內上傳
點擊“確認”
紅色方框的就是我們需要的基因名！ 緊接著，一個個把這些基因名在剛剛的原始數(shù)據(jù)中尋找。
可以輕松獲得該行
接著把這一整行復制貼上到新的excel中
記得貼上的時候一定要選擇“轉置”這個按鈕 將橫的數(shù)據(jù)變成豎的 進一步修改名稱為CCNA2
同樣道理可以整理出另外5個基因的表達情況 最后整理成一個表達矩陣
接著，我們打開相關性熱圖 路徑：基礎繪圖——相關性熱圖
在框中上傳我們適才保存好的文件，類型選擇“樣式1，位置選擇“顯示相關系數(shù)”，在樣式中選擇“圓形”。點擊確認。
即可出圖！
5
這個圖是本文干濕結合的體現(xiàn)之一。 Fig5A-5L是作者通過濕實驗得到的結果，而M到R則是驗證了組織里面的表達情況。 （黑衣人：蛤？那我們不就做不了了嗎？） （濤濤醬：別慌！仙桃在手，要什么都有！） 正確打開方式如下： 表達差異（挑）——表達差異——配對樣本
選擇TCGA—LIHC，肝細胞肝癌 分子選擇 CCNA2
選擇“不顯示箱式圖”
點擊“確認”
即可出圖 同樣的道理，輸入另外五個基因，也能得到一樣的結果。 （黑衣人：哇！這樣就能將濕實驗轉化為干實驗！好強！） （濤濤醬：哈哈，這就強了嗎？后面還有更精彩的！請往下看！） 6
（濤濤醬：這個乍一看是什么圖呢？） （黑衣人：不就是免疫組化的圖嘛！） （濤濤醬：對的，但是作者在此非常討巧地用了數(shù)據(jù)庫的圖片實現(xiàn)） （黑衣人：驚！還能這樣！） 通過文章的材料與方法部分，我們驚訝地發(fā)現(xiàn)，這個部分披上了濕實驗地軀殼，沒想到里面竟然是干實驗的靈魂！
所以我們就按照這個步驟一起來看看如何實現(xiàn)吧！ 那就隆重推出我們的HPA數(shù)據(jù)庫（https://www./） Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫，簡稱HPA數(shù)據(jù)庫，它致力于提供全部24,000種人類蛋白質的組織和細胞分布信息，并免費提供公眾查詢。 創(chuàng)立這個數(shù)據(jù)庫的瑞典 Knut & Alice Wallenberg基金會使用特制的抗體，用免疫組化的技術，檢查每一種蛋白質在48種人類正常組織，20種腫瘤組織，47個細胞系和12種血液細胞內的分布和表達，其結果用至少576張免疫組化染色圖表示，并經(jīng)專業(yè)人員閱讀和標引。這些受檢組織來自144個不同個體和216個腫瘤組織，保證染色結果具有充分的代表性。這是一個大規(guī)模蛋白質研究項目，主要目的是繪制人體組織和細胞中表達基因編碼的蛋白位置。 那么該如何使用呢？ 登入網(wǎng)址。
在搜尋框搜尋CCNA2
結果可以看到正常組織、病理狀態(tài)下等等不同的樣式。 我們選取“TISSUE”這個界面 就會看到
由于我們要研究的是肝細胞癌，所以我們選中右側的liver
結果顯示
是不是和Fig6A長得一模一樣？ 所以同理可以輸入其他基因，復現(xiàn)出后續(xù)的圖片。 7
根據(jù)文中描述，作者在此做了單因素分析
所以我們一起來看一下如何實現(xiàn)。 不過，在復現(xiàn)之前 濤濤想和大家說的是，這個功能目前只有高級版才能實現(xiàn)喔！ （黑衣人：蛤？這樣啊，那我趕緊把我的基礎版升級一下！這么好用的功能！） 一定要 買它?。。。持鞑ド仙恚?/span>
進入仙桃的高級版界面
臨床意義（靠）——預后分析——單因素|多因素分析 選擇疾病TCGA—LIHC 把內建的條目刪除，重新添加
輸入具體的基因名
之后點擊“確認” 就出來運算結果了
我們保存excel表格
接著我們將表格整理一下 只留下這三列
保存Excel 接著打開“基礎繪圖——森林圖”
上傳Excel文檔，點擊“確認” 立刻出結果
8
我們先來看看Fig 8A 是如何做出來的
Fig 8A是CCNA2的生存曲線 打開路徑 臨床意義（靠）——預后分析——KM曲線
選擇疾病TCGA—LIHC 輸入對應的分子
點擊確認
即可出圖 在此，希望大家能點一個“保存結果”，等下就可以直接拼圖了喔！ 同樣道理，可以獲得另外五個基因的KM曲線圖。 接下來，就到了我們最緊張最激動的拼圖環(huán)節(jié)啦！ 將6張圖拼起來，就意味著可以得到我們的Fig 8 接下來我們來看看如何一鍵拼圖！
點擊上方的拼圖工具
左邊的欄目中即有我們剛剛保存的6張圖 一個個將其拖曳至主屏幕
拖曳的時候有自動上下左右前后對齊喔！ （黑衣人：想起了以前軍訓時候，教官說的，向左向右看！） （濤濤醬：沒錯！我們的仙桃拼圖工具就是有如軍隊一般嚴謹可靠！）
更有橫縱參考線讓你對齊，更好用喔！
點擊pdf下載即可。 （黑衣人：欸欸欸！等等！字母還沒標欸！） （濤濤醬：哈哈，你打開pdf看看？）
（黑衣人：震驚?。?！字母竟然自己標上去了！還對得那么整齊?。?！） （濤濤醬：對吧？所以，仙桃真的是神仙本仙！很好用吧！） （黑衣人：哇喔！太強了吧！respect！我這就立刻登陸仙桃www.開始腫瘤類GEO研究之旅！） 歡迎大家關注解螺旋生信頻道-挑圈聯(lián)靠公號~  |
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來自： 外科黃文斌 > 《生信數(shù)據(jù)庫》
