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編譯：夕夕，編輯：十九、江舜堯。 原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。 導(dǎo)讀
空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)的最新進(jìn)展極大地?cái)U(kuò)展了復(fù)雜的多細(xì)胞生物系統(tǒng)的知識(shí)。近年來(lái)，該領(lǐng)域迅速擴(kuò)展，并且已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種旨在將基因表達(dá)數(shù)據(jù)與空間信息相結(jié)合的新技術(shù)。盡管該領(lǐng)域正在快速發(fā)展，但仍然存在許多挑戰(zhàn)需要解決，包括敏感性，組織類型依賴性以及獲得詳細(xì)單細(xì)胞信息的能力有限。。目前，沒(méi)有任何一種方法可以解決所有問(wèn)題。本文中，主要描述了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，并討論了它們的應(yīng)用以及它們的優(yōu)缺點(diǎn)。探索未來(lái)的發(fā)展，并探討該領(lǐng)域的發(fā)展方向。原名：Spatially Resolved Transcriptomes—Next Generation Tools for Tissue Exploration 譯名：空間分辨轉(zhuǎn)錄組-用于組織探索的下一代工具期刊：BioEssays（2區(qū)） IF: 4.396 發(fā)表時(shí)間：2020.3 通訊作者：Joakim Lundeberg 通訊作者單位: 瑞典KTH皇家理工學(xué)院工程科學(xué)學(xué)院化學(xué)生物技術(shù)和衛(wèi)生部基因技術(shù)科學(xué)生命實(shí)驗(yàn)室 DOI號(hào)： 10.1002/bies.201900221 在生物學(xué)中，空間概念具有重要意義因?yàn)樗梢宰屛覀兠枋鼋换ナ缴锞W(wǎng)絡(luò)，每個(gè)元素都受到周?chē)h(huán)境的影響。例如，只有知道多細(xì)胞生物的物理位置后，才能完全理解它們的分子特性。原因是不同組織微環(huán)境中的細(xì)胞表達(dá)特定的基因集，因?yàn)樗鼈兌际艿街車(chē)?xì)胞的影響，并對(duì)其周?chē)募?xì)胞產(chǎn)生影響。例如，腫瘤微環(huán)境，其中幾個(gè)構(gòu)成腫瘤的癌細(xì)胞亞群在兩個(gè)結(jié)構(gòu)特征方面可能完全不同。如果我們進(jìn)一步縮小到單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞壁內(nèi)的微環(huán)境，空間概念就變得同樣重要，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)功能和信號(hào)傳遞需要細(xì)胞內(nèi)精確的位置參數(shù)。 沿著這條線，RNA分子的亞細(xì)胞位置可以推斷出有關(guān)轉(zhuǎn)錄信息及其實(shí)際生物學(xué)意義的重要信息。目前尚未得到空間組織的重要性和分子的確切位置的信息，這推動(dòng)了空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)的技術(shù)進(jìn)步。本文，作者總結(jié)了可用空間技術(shù)的概況，并將不同的方法分為五個(gè)類別：基于微觀基因表達(dá)技術(shù)；原位雜交技術(shù)；原位測(cè)序技術(shù)；原位捕獲技術(shù)和空間數(shù)據(jù)重構(gòu)。圖1顯示了本文提到的方法的簡(jiǎn)要時(shí)間表，表1列出了各個(gè)方法的特征。
表1 空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)之間的比較
1.1基于顯微解剖基因表達(dá)的技術(shù)捕獲空間基因表達(dá)信息的方法是從樣品中分離出目標(biāo)區(qū)域。然后可以將這些區(qū)域分別放置在試管中，以進(jìn)行RNA提取和隨后的基因表達(dá)譜分析。進(jìn)行亞型分析等，但覆蓋較大的區(qū)域通常很麻煩，并且在整個(gè)組織中獲取整體圖像通常是不可行的。整個(gè)技術(shù)流程見(jiàn)圖2。
圖2 基于顯微解剖基因表達(dá)的技術(shù)概述
激光捕獲顯微切割（LCM）是一種技術(shù)，使用激光束切除在顯微鏡下識(shí)別出的組織區(qū)域。在2017年，對(duì)LCM技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，稱為Geo-seq。將LCM與單細(xì)胞RNA測(cè)序結(jié)合，以分析小至10個(gè)單細(xì)胞的組織區(qū)域。盡管LCM是一項(xiàng)強(qiáng)大的技術(shù)，但該技術(shù)的工作量很高，這限制了要分析的樣本通量。將組織樣本切成薄薄的冷凍切片也可以分析區(qū)域化基因表達(dá)數(shù)據(jù)。2013年，將該方法應(yīng)用于果蠅胚胎，在果蠅胚胎中沿前后體軸進(jìn)行了冷凍切片和測(cè)序，揭示了已知和新發(fā)現(xiàn)的空間基因表達(dá)模式。RNA斷層掃描避免了對(duì)RNA載體的需要。有研究人員冷凍切片了三個(gè)相同的斑馬魚(yú)胚胎，每個(gè)都沿著前后，腹背和左右進(jìn)行切割。然后通過(guò)重疊來(lái)自所有冷凍切片的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息以重構(gòu)胚胎的3D轉(zhuǎn)錄圖譜。與早期的冷凍切片方法相比，此方法在RNA定量和動(dòng)檢分辨率方面都更加出色。目前，RNA斷層掃描無(wú)法應(yīng)用于臨床樣品。體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組分析（TIVA）可用于分析活細(xì)胞。在TIVA流程中，完整的活組織切片首先要暴露于TIVA tags。這些tags附著在可穿透細(xì)胞的肽上，使它們能夠進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)。接著，通過(guò)激光激活選擇感興趣的細(xì)胞，然后激活TIVA tags并與細(xì)胞內(nèi)的mRNA雜交。然后從選定的細(xì)胞中提取mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并分析。但TIVA的局限性是通量較低，一次智能分析幾個(gè)細(xì)胞。在細(xì)胞微環(huán)境中分析生態(tài)位的另一種方法是ProximID。由于大多數(shù)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)都專注于細(xì)胞是否緊密靠近，因此ProximID通過(guò)觀察細(xì)胞之間的實(shí)際物理相互作用將其進(jìn)一步發(fā)展。首先在溫和的條件下將組織解離，從而保留包含兩到三個(gè)細(xì)胞的小相互作用結(jié)構(gòu)。 然后，手動(dòng)顯微切割相互作用的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq處理。 然而，手動(dòng)顯微解剖的工作量較大，因此在通量方面受到限制。ISH技術(shù)自1960年代就已經(jīng)存在，并且從1980年代初開(kāi)始一直用于可視化基因表達(dá)。熒光標(biāo)記的探針?lè)謩e與預(yù)定的RNA雜交，以可視化固定組織中的基因表達(dá)。熒光原位雜交（FISH）的進(jìn)一步發(fā)展反而利用了多個(gè)較短的探針，它們可以靶向同一轉(zhuǎn)錄本的不同區(qū)域。這種稱為單分子RNA熒光原位雜交（smFISH）的方法可提供更高且更穩(wěn)定的信號(hào)，可以對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量測(cè)量。最初，一組五個(gè)探針（50 bp）分別與五個(gè)熒光團(tuán)偶聯(lián)，用于靶向每個(gè)轉(zhuǎn)錄本。但是，由于雜交特性的改變以及合成和純化的復(fù)雜性，具有大量熒光團(tuán)的標(biāo)記探針具有挑戰(zhàn)性。但是，由于雜交特性的改變和自猝滅以及合成和純化的復(fù)雜性，具有大量熒光團(tuán)的標(biāo)記探針具有挑戰(zhàn)性。盡管smFISH具有高靈敏度和亞細(xì)胞空間分辨率，但是由于光譜的固有局限性，它一次只能定位幾個(gè)基因。2014年開(kāi)發(fā)了基于順序雜交的多重smFISH方法。通過(guò)一系列連續(xù)的雜交，成像和探針剝離檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本。在每次雜交過(guò)程中，為每個(gè)靶標(biāo)使用24個(gè)編碼探針。但是，雜交次數(shù)的增加需要增加探針數(shù)量。基于FISH的方法的一個(gè)普遍問(wèn)題是組織樣品類型。2011年，Advanced Cell Diagnostics推出了商用RNAscope分析儀。該方法的核心是探針設(shè)計(jì)，其中兩個(gè)相鄰的“ Z探針”與靶RNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，形成隨后的擴(kuò)增子分子雜交所需的結(jié)合位點(diǎn)。信號(hào)放大所需的雜交級(jí)聯(lián)反應(yīng)遵循分子分析中通常采用的逐步結(jié)合的概念，以增加信噪比。在2019年7月，同時(shí)檢測(cè)到的RNA靶標(biāo)的最大數(shù)量增加到12個(gè)。低多重RNAscope也已與成像質(zhì)量細(xì)胞術(shù)（IMC）結(jié)合使用，其中DNA樹(shù)與金屬標(biāo)簽雜交。到目前為止，已經(jīng)證明了該方法可用于較少數(shù)量的同時(shí)mRNA和蛋白質(zhì)靶標(biāo)，并且所提出的方案化學(xué)方法可確保進(jìn)一步評(píng)估表位檢測(cè)的最終極限。在2019年，提出了一種稱為“ DNA顯微鏡”的無(wú)光學(xué)核苷酸定位圖，該圖不依賴于已知位置的物理捕獲，而是依賴于熱力學(xué)熵。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備，傳感器定位理論采用了位置重建方法。UMI構(gòu)建體在隨后的一輪隨機(jī)核苷酸插入中鏈接在一起，從而產(chǎn)生“唯一事件標(biāo)識(shí)符”（UEIs）。該概念的核心是目標(biāo)原始源之間的物理距離將反映UEI形成的可能性。 對(duì)連接體進(jìn)行DNA測(cè)序后，該流行度將用于推斷不同靶標(biāo)之間的鄰近性，因此可以創(chuàng)建圖像以及有關(guān)靶標(biāo)的單核苷酸信息。迄今為止，該技術(shù)僅在培養(yǎng)細(xì)胞中僅對(duì)少部分轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了證明。2013年發(fā)布了第一個(gè)基于原位測(cè)序的方法，該方法使用掛鎖探針靶向已知基因。在完整的組織切片中，mRNA首先被反轉(zhuǎn)錄為cDNA，掛鎖探針可以與cDNA結(jié)合。掛鎖探針是包含與靶標(biāo)cDNA區(qū)域互補(bǔ)的單鏈DNA。該方法有兩種選擇，一種是掛鎖探針與cDNA靶標(biāo)結(jié)合，兩端之間有一個(gè)縫隙，另一種是兩端彼此相鄰。在第一種情況下，通過(guò)DNA聚合來(lái)填補(bǔ)缺口。然后在兩種情況下，都會(huì)將末端連接起來(lái)形成一個(gè)DNA環(huán)。目標(biāo)擴(kuò)增是通過(guò)稱為滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）的過(guò)程進(jìn)行的，從而產(chǎn)生了微米級(jí)的RCA產(chǎn)物（RCP），其中包含許多掛鎖探針序列的重復(fù)序列。然后，對(duì)RCP進(jìn)行連接測(cè)序（SBL）。無(wú)間隙方法顯示出更高的靈敏度，而間隙填充方法可以讀取轉(zhuǎn)錄本的序列，其中間隙的可變長(zhǎng)度可達(dá)4bp。通過(guò)將ISS應(yīng)用于乳腺癌組織切片，可以對(duì)31個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行空間定位。與基于雜交的技術(shù)相比，此方法具有檢測(cè)SNV的能力。CARTANA公司于2017年成立，主要用于提供樣本預(yù)處理試劑盒和服務(wù)。2019年，ISS分析可以在微流體平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，可以顯著降低整個(gè)流程的運(yùn)行時(shí)間。3.2 空間分辨的轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增比對(duì)ISS最近開(kāi)發(fā)的另一種方法是空間解析的轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增比對(duì)（STARmap）。STARmap使用帶條形碼的掛鎖探針，該探針與靶標(biāo)雜交。可通過(guò)添加第二個(gè)引物來(lái)避免逆轉(zhuǎn)錄。該方法避免了cDNA轉(zhuǎn)換的效率低，并通過(guò)添加第二個(gè)雜交步驟降低了噪音。然后通過(guò)RCA擴(kuò)增該構(gòu)建體，以生成稱為納米球的納米級(jí)單鏈DNA產(chǎn)物。隨后清除組織-水凝膠復(fù)合物的未結(jié)合蛋白和脂質(zhì)，從而增強(qiáng)組織的透明度。 接下來(lái)，采用改進(jìn)的SBL方法解碼5bp的barcode。通過(guò)結(jié)合使用水凝膠組織化學(xué)方法和改良的測(cè)序方案，在小鼠腦組織切片中靶向了1000多個(gè)基因。2014年出現(xiàn)了一種無(wú)目標(biāo)的方法可以捕獲所有種類的RNA，稱為熒光原位RNA測(cè)序（FISSEQ）。首先，使用常規(guī)的和修飾的胺堿與標(biāo)記的隨機(jī)六聚體RT引物混合在一起進(jìn)行cDNA合成。最后，使用讀取長(zhǎng)度為30bp的SBL進(jìn)行測(cè)序。但是，為了區(qū)分大量不同的靶標(biāo)，可通過(guò)使用擴(kuò)展的測(cè)序引物來(lái)應(yīng)用分區(qū)測(cè)序策略，其中隨機(jī)采樣納米球，從而僅對(duì)一個(gè)子集進(jìn)行測(cè)序。2016年，成立了ReadCoor公司，該公司將該技術(shù)商業(yè)化。2020年，該公司公布了他們的第一條產(chǎn)品線，包括一個(gè)完整的集成系統(tǒng)，據(jù)說(shuō)該系統(tǒng)能夠在亞細(xì)胞水平上分辨同一組織切片上同時(shí)檢測(cè)RNA，DNA和蛋白質(zhì)。在2019年，FISSEQ的研究小組提出了原位轉(zhuǎn)錄組可行性測(cè)序。4. 空間數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)重建除了上述介紹的實(shí)驗(yàn)方法外，還可以計(jì)算方法構(gòu)建空間的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。這項(xiàng)技術(shù)通過(guò)分離單細(xì)胞基于他們的表達(dá)譜數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算他們的空間位置。細(xì)胞的空間定位可以基于他們的參考圖譜實(shí)現(xiàn)，或是通過(guò)重頭組裝的方法實(shí)現(xiàn)。2015年，發(fā)表了兩種使用ISH參考數(shù)據(jù)庫(kù)的類似計(jì)算方法。第一個(gè)是將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合到斑馬魚(yú)胚胎上，而其他數(shù)據(jù)則關(guān)注于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物。通過(guò)計(jì)算方法將組織劃分為較小的區(qū)域來(lái)創(chuàng)建參考圖譜，并根據(jù)ISH參考數(shù)據(jù)庫(kù)將單個(gè)細(xì)胞定位到組織上。另一個(gè)算法DistMap發(fā)表于2017年，該算法是通過(guò)ISH參考數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行空間定位。這些方法適用于已知的生物樣本和組織結(jié)構(gòu)。使用現(xiàn)有的ISH數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建空間參考圖譜，以便將分析限制于ISH圖譜上已經(jīng)存在的組織類型。基于參考圖譜的方法的準(zhǔn)確性取決于參考圖譜的質(zhì)量和可用性。因此，開(kāi)發(fā)不依賴參考圖譜重構(gòu)空間定位的方法十分重要。這種方法稱為NovoSpaRc。在沒(méi)有參考圖譜的情況下，可以基于在整個(gè)組織切片中基因表達(dá)的變化進(jìn)行假設(shè)。其核心是相鄰的細(xì)胞的表達(dá)模式比相距較遠(yuǎn)的細(xì)胞表達(dá)模式更相似。該方法已經(jīng)在果蠅和斑馬魚(yú)胚胎等組織中得到證實(shí)，目前還需要做進(jìn)一步的工作才能在更復(fù)雜的組織上獲得詳細(xì)的表達(dá)圖譜。此外，作者指出一組具有已知表達(dá)模式的標(biāo)記基因可以顯著改善計(jì)算結(jié)果。上述介紹的方法是使用不同的策略獲得空間轉(zhuǎn)錄信息。然而，這些策略的結(jié)果類似，一些具有出色分辨率的方法正在逐漸優(yōu)化而且基于全轉(zhuǎn)錄組的捕獲放在也在逐步提高其分辨率。目前，還有有一種方法得到空間分辨轉(zhuǎn)錄組的最終目標(biāo)：無(wú)偏見(jiàn)，完整的轉(zhuǎn)錄組譜分析。為使用現(xiàn)有方法實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)，必須將這些方法結(jié)合起來(lái)并利用他們各自的優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)在正在進(jìn)行的大型項(xiàng)目，例如旨在創(chuàng)建人類細(xì)胞參考圖譜項(xiàng)目，正在致力于解決以下問(wèn)題：如何在不同平臺(tái)上整合信息，將數(shù)據(jù)從不同模式下映射到參考圖譜上。將空間和非空間的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合到一起的計(jì)算方法是創(chuàng)建此類圖譜的基礎(chǔ)。目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了其他幾種方法來(lái)講單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和雜交或ISS數(shù)據(jù)融合，最近還可以將組織學(xué)成像數(shù)據(jù)與捕獲數(shù)據(jù)融合。6.常見(jiàn)缺點(diǎn)和注意事項(xiàng)在使用此處介紹的空間方法時(shí)，作者想強(qiáng)調(diào)一些容易忽略的信息：a. FOV，即可以在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析的組織的總大小，將在很大程度上決定該研究的可行性。例如，基于FISH的方法的FOV有限，并且依賴于大量的高分辨率圖像。b.軟件可用性，目前還有很多技術(shù)沒(méi)有分析軟件。盡管商業(yè)供應(yīng)商正在開(kāi)發(fā)自己的軟件，而且學(xué)術(shù)界也在努力創(chuàng)建同一的分析流程，但研究該流域的研究人員目前還是創(chuàng)建內(nèi)部軟件來(lái)解決他們的特定問(wèn)題。d.樣本類型，盡管現(xiàn)在通常使用FFPE樣本，但是大多數(shù)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的樣本只能是新鮮的冷凍組織。e.最后，當(dāng)前技術(shù)的固有局限在于，他們只提供動(dòng)態(tài)圖譜。因此，對(duì)時(shí)空轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究是通過(guò)使用不同時(shí)間點(diǎn)的多個(gè)樣本或使用非空間單細(xì)胞研究來(lái)進(jìn)行的。毫無(wú)疑問(wèn)，空間信息對(duì)推斷更深層次的生物學(xué)意義具有重要意義，但是目前的技術(shù)限制了他的各種應(yīng)用。盡管目前空間分辨組學(xué)在臨床上已經(jīng)有了一定應(yīng)用，例如使用免疫組化和FISH技術(shù)。但如今，利用更全面的空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析組織樣本在很大程度上是一項(xiàng)基礎(chǔ)研究工作。但是，這些技術(shù)可能會(huì)成為個(gè)性化醫(yī)學(xué)的重要工具，在一些組織中，局部作用的免疫反應(yīng)和克隆可能對(duì)于治療診斷十分重要。但是，這些技術(shù)應(yīng)用于臨床還需要解決工作流程復(fù)雜，費(fèi)用較高等問(wèn)題。目前，本文介紹的許多技術(shù)都沒(méi)有解決這些問(wèn)題，因此無(wú)法在臨床上廣泛應(yīng)用。推動(dòng)技術(shù)快速發(fā)展的一個(gè)重要因素是進(jìn)行大量合作研究，以創(chuàng)建全面且公開(kāi)的圖譜。同時(shí)需要采用新的分析工具和標(biāo)準(zhǔn)化流程，以實(shí)現(xiàn)所有不同技術(shù)的集成，每種技術(shù)都具有獨(dú)特的特征，數(shù)據(jù)合適和生物學(xué)優(yōu)勢(shì)。空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域正在加速發(fā)展，并且由于這些技術(shù)的發(fā)展可以使研究人員探索更多生物學(xué)信息。
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