1. 首先制備GO-Fe₃O₄/SiO₂/Ti⁴⁺(GFST)復合材料，然后利用透射電鏡對GFST的形貌進行表征；

2. 利用Ti⁴⁺磷酸基團螯合和靜電吸附相結(jié)合的方法合成一種新的SEV分離復合材料，用超速離心法從HeLa細胞中分離SEV作為模型樣品以評價GFST法分離SEV的效果；

3. SDS-PAGE分析（銀染）從模型SEV樣品、培養(yǎng)后的上清液、洗滌液和吸附在GFST上的洗脫SEV中提取的蛋白質(zhì)；

4. Western blot分析來評估GFST的量對SEV分離效率的影響；

5. 采用MALDI-TOF-MS分析胰蛋白酶消化α-酪蛋白來證明GFST對磷酸肽的富集能力。

1. GO-Fe₃O₄/SiO₂/Ti⁴⁺(GFST)復合材料的制備與表征

GFST的制備程序如方案1所示。首先，我們通過溶劑熱反應將Fe₃O₄納米粒子分散在GO表面；接下來，我們通過溶膠-凝膠反應在GO-Fe₃O₄復合材料上覆蓋一層SiO₂，并進一步用NH₂基團對其進行改性。隨后，大環(huán)螯合劑DOTA–NHS–酯是通過氧化GO-Fe₃O₄上的氨基與DOTA–NHS–酯的琥珀酰亞胺基團反應而與復合材料表面共價結(jié)合的。最后，我們通過金屬離子的DOTA螯合作用將Ti⁴⁺固定在復合材料上。所制備的復合材料具有氧化石墨烯比表面積大、磁性納米粒子磁響應好、DOTA螯合性強等優(yōu)點。因此，金屬離子負載量高，易于分離，回收率高。

我們用透射電鏡對GFST的形貌進行了表征。如圖1所示，GO呈現(xiàn)薄片形式（圖1A），并且在溶劑熱反應后許多Fe₃O₄納米顆粒點綴在GO上。Fe₃O₄納米顆粒呈均勻形狀，平均直徑約為100 nm（圖1B）。我們在溶膠-凝膠組裝后的TEM圖像中可以觀察到完全覆蓋GO-Fe₃O₄的二氧化硅殼（圖1C）。二氧化硅殼層賦予復合材料氨基，我們可以用DOTA–NHS–酯和金屬離子進一步功能化。我們用ICP-OES法測定固定在GFST上的Ti⁴⁺量，如圖S1A所示，Ti⁴⁺的負載能力為52.07 μg/mg，比文獻中報道的同類材料的負載能力大。由于GO具有較大的比表面積和DOTA的強螯合作用，使GFST具有良好的SEV分離和磷酸肽富集性能。改性后，復合材料的荷電狀態(tài)從最初的帶負電轉(zhuǎn)變?yōu)閹д姷?/span>GFST（圖S1B）。因此，與靜電中性TiO₂相比，正電荷GFST通過靜電吸附和金屬磷酸基團螯合的方式捕獲負電荷SEV具有明顯的優(yōu)勢。GO和GFST的磁性能如圖S1C和圖S1D所示，用Fe₃O₄納米粒子修飾GO后，GO具有明顯的磁性，可以很容易地從溶液中分離出來。

圖1 (A) GO薄片，(B) GO-Fe₃O₄和(C) GFST的TEM圖像

 方案1 GFST合成程序的示意圖

2. 基于GFST的SEV分離的驗證

Ti⁴⁺與磷酸基團的螯合作用已廣泛應用于磷酸肽的富集?？紤]到SEV被磷脂雙層膜覆蓋，我們利用同樣的Ti⁴⁺-磷酸基團螯合和靜電吸附相結(jié)合的方法合成了一種新的SEV分離復合材料。我們用超速離心法從HeLa細胞中分離SEV作為模型樣品，評價GFST法分離SEV的效果。在使用前，通過TEM和NTA分析對模型SEV進行了表征（圖S2）。為了獲得基于GFST的SEV捕獲的視覺檢測，我們使用兩種特異性識別常用SEV標記蛋白的抗體進行了免疫熒光實驗。如圖2所示，綠色（CD81）和紅色（TSG101）熒光在與模型SEVs孵育后可在GFST表面清楚地檢測到。與此相反，我們在GFST上只發(fā)現(xiàn)了極小的背景熒光，而沒有與SEV模型孵育，這表明SEV的捕獲是高度選擇性的。 

圖2 熒光圖像顯示綠色FITC抗CD81抗體和橙色TRITC抗TSG101抗體在GFST表面的SEVs

培養(yǎng)后，幾乎所有SEV都吸附在GFST上，富集效率得到提高；同樣，我們在洗滌液中幾乎找不到蛋白條帶。我們認為，在洗滌過程中，由于GO的高比表面積和GFST與SEVs之間通過螯合作用和靜電作用的強結(jié)合，SEVs的高效捕獲和樣品損失最小。如圖3所示，洗脫的SEV蛋白顯示出與原始模型SEV蛋白相似的條帶模式，具有良好的樣品回收率。我們進一步研究了基于GFST的SEV分離的重現(xiàn)性。我們用SDS-PAGE對三個GFST分離實驗的上清液和洗脫液中的蛋白質(zhì)提取物進行了表征。如圖S3所示，我們從三個分離實驗獲得的洗脫液中提取的蛋白質(zhì)顯示出相同的條帶模式，但上清液中幾乎沒有可檢測的條帶，表明獲得了高度可重復的SEV富集。我們用氨水進一步洗脫捕獲的SEV，并用TEM圖像進行表征。如圖S4所示，洗脫的SEV呈現(xiàn)典型的茶杯結(jié)構(gòu)，直徑約為150 nm。結(jié)果表明，GFST可以分離出結(jié)構(gòu)完整的SEV，分離過程是可逆的。為了評價靜電吸附在GFST基SEVs富集中的作用，我們還使用了帶正電的GO- Fe₃O₄/SiO₂/DOTA進行SEV分離，并與帶負電的GO進行了比較。如圖S5所示，GO- Fe₃O₄/SiO₂/DOTA可富集少量SEV，凝膠中顯示TSG101條帶，但GO富集SEV后未發(fā)現(xiàn)微量TSG101，表明使用帶正電材料富集帶負電SEV的優(yōu)勢。在GFST通道中發(fā)現(xiàn)了更強的TSG101帶，這是由于Ti⁴⁺在GFST上的螯合作用和靜電相互作用。GFST前后SEVs模型的蛋白質(zhì)組圖譜顯示，在GFST富集的SEVs中鑒定的蛋白質(zhì)有效地覆蓋了SEVs模型中蛋白質(zhì)組的78.1%（圖S6），表明GFST可以有效地捕獲SEVs用于后續(xù)的蛋白質(zhì)組研究。 

圖3 SDS-PAGE分析（銀染）從模型SEV樣品、培養(yǎng)后的上清液、洗滌液和吸附在GFST上的洗脫SEV中提取的蛋白質(zhì)

3. SEV分離條件的優(yōu)化

我們首先根據(jù)分離的SEVs蛋白提取物中TSG101的Western blot分析來評估GFST的量對SEV分離效率的影響。如圖4A和圖S7A所示，隨著GFST量的增加，SEV富集效率先增加后降低，可能是由于GFST過量導致混合不足。當GFST濃度為0.5 mg時，富集效率最高可達74.3%。如圖4B和圖S7B所示，GFST能夠在培養(yǎng)10 s后富集50%以上的SEV，這是已報道的最快的；當孵育時間延長到5分鐘時，可達到83.1%的富集效率；而我們使用SEV表面標記蛋白CD9也可獲得類似的結(jié)果（81.2%）（圖S7C）。快速高效的SEV富集又一次歸因于GFST的大比表面積以及螯合作用和靜電作用的結(jié)合，與基于超速離心的SEV分離所需的專用儀器和大約8小時的樣品處理相比，GFST策略具有明顯的優(yōu)勢，具有低成本和高樣品吞吐量。與我們之前的研究相比，GFST使隔離時間縮短了約2倍，承載能力提高了4倍。

圖4 GFST分離SEVs條件的優(yōu)化

SEVs模型的分離效率是GFST和孵育時間的函數(shù)

4. 血清SEV的分離及蛋白質(zhì)組學分析

在用SEVs模型證明GFST分離SEV的有效性后，我們進一步用更復雜的血清樣品對分離方法提出了挑戰(zhàn)。血清/血漿SEV作為生物標志物篩選的重要來源，特別是為了更好地了解免疫介導的腫瘤逃逸和預測患者對免疫治療的反應，近年來受到越來越多的關注。從人血清、上清液、洗滌液和洗脫液中提取的蛋白經(jīng)GFST孵育后進行SDS-PAGE鑒定。如圖5A所示，高度豐富的人類白蛋白覆蓋了血清蛋白質(zhì)組的通道，甚至上清液和第一洗滌液的通道。然而，隨著洗滌次數(shù)的增加，人類蛋白會減少，這表明它們會不斷地從系統(tǒng)中去除，洗脫后的SEVs有明顯不同的蛋白帶型。我們使用常用的SEV標記蛋白TSG101（圖5B），通過Western blot分析確認這些SEV的特性。上述結(jié)果表明，基于GFST的SEVs選擇性富集在高復雜樣品中仍然有效。從GFST分離的血清SEVs中獲得的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE特征表明，三個重復實驗中的蛋白質(zhì)條帶模式幾乎相同（圖S8），表明基于GFST的SEVs分離在高度復雜的樣品中仍然有效。我們通過質(zhì)譜分析進一步表征富集GFST的SEVs的蛋白質(zhì)組，并將其與常用的超速離心和基于共沉淀的SEVs分離方法獲得的蛋白質(zhì)組進行比較，如圖5C所示。我們從三個生物復制的100 μL血清樣本中，共鑒定出515個蛋白組，比基于超速離心（274個蛋白質(zhì)）和共沉淀（253個蛋白質(zhì)）的SEVs富集方法（支持信息，表S1）獲得的蛋白質(zhì)組多約一倍，比我們以前的結(jié)果多34.1%。細胞組分的基因本體分析（DAVIDBioinformatics Resources）表明，細胞外SEVs是GFST富集的SEVs蛋白質(zhì)組中最富集的項目，但在超速離心和共沉淀分離的SEVs蛋白質(zhì)組中僅第三和第四富集的項目（圖S9）。雖然我們在GFST富集產(chǎn)物中通過熒光和Western blot分析檢測到TSG101和CD81，但是在基于蛋白質(zhì)組學的測試中沒有發(fā)現(xiàn)這些已知的EV標記蛋白，可能是由于質(zhì)譜的檢測靈敏度有限。為了對三種分離方法獲得的SEV蛋白質(zhì)組進行定量比較，我們將重點放在血清SEV結(jié)果中鑒定的蛋白質(zhì)和ExoCarta數(shù)據(jù)庫中列出的EV蛋白質(zhì)上。所有361個匹配蛋白質(zhì)的無標記定量（LFQ）強度（支持信息，表S2）表明，大多數(shù)蛋白質(zhì)在GFST富集產(chǎn)物中顯示出比其他兩種方法更高的豐度（圖S10），表明GFST富集SEV的高富集效率。我們進一步評估了GFST與超速離心（通常采用的SEVs分離方法）相比的富集特異性（圖S11），兩種方法的典型脂蛋白含量相近，但GFST富集產(chǎn)物的含量略高。GFST富集產(chǎn)物中的脂蛋白污染可能是由于GFST富集的脂蛋白顆粒表面存在磷脂，因此，對于需要高純度的研究，我們建議使用補充分離方法進一步富集，例如抗體免疫沉淀法，從GFST分離的SEV中去除脂蛋白顆粒。

圖5 （A）SDS-PAGE分析（銀染）GFST分離的血清SEVs的蛋白質(zhì)，（B）使用TSG101對GFST分離的血清SEVs進行Western印跡分析，（C）通過超速離心、共沉淀試劑盒和GFST分離的SEVs中鑒定的蛋白質(zhì)組重疊。

5. 血清SEVs磷蛋白組的單物質(zhì)富集

我們用胰蛋白酶消化α-酪蛋白來證明GFST對磷酸肽的富集能力。富集前后胰蛋白酶消化α-酪蛋白的MALDI-TOF-MS分析如圖S12A所示。由于高豐度非磷酸肽的干擾，富集前我們只能鑒定出三種磷酸肽。經(jīng)GFST富集后，我們共鑒定出19個磷酸肽（圖S12B，表S3A），并且接近一半的已鑒定磷酸肽（9/19）具有多磷酸化位點，這表明GFST對單磷酸肽和多磷酸肽都具有良好的富集效率。為了進一步挑戰(zhàn)用于磷酸肽富集的GFST材料，我們使用由β-酪蛋白和BSA的胰蛋白酶消化物（m/m=1:100）組成的更復雜樣品。如果沒有富集，光譜會被非磷酸肽淹沒，并且無法識別磷酸肽（圖S13A）。相比之下，三種覆蓋β-酪蛋白所有已知磷酸位點的磷酸肽被鑒定為具有高信號強度比，并且在通過GFST富集后能夠明顯去除非磷酸肽（圖S13B，表S3B）。為了進一步研究GFST富集磷酸肽的選擇性，以HeLa細胞的全細胞裂解液為真實樣品，得到4875個磷酸肽和363個非磷酸肽，富集選擇性高達93.1%（支持信息表S4）。以上結(jié)果證明，我們的GFST材料不僅可以從標準磷酸化蛋白中富集磷酸肽，而且對復雜的生物樣品也有很高的富集效率。

考慮到SEVs的可用性有限和蛋白質(zhì)磷酸化豐度低，我們采用不同材料或相容性差的方法分別富集SEVs和磷酸肽的串聯(lián)富集策略可能導致嚴重的樣品丟失，因此，我們提出了基于GFST的單一材料策略，利用Ti⁴⁺與磷酸基團之間的親和力來富集SEVs和磷酸肽。我們使用同一批GFST直接對GFST捕獲的sev進行裂解、消化和磷酸肽富集（方案2），通過使用GFST串聯(lián)富集SEVs和磷酸肽，我們成功富集并鑒定了血清SEVs中530個磷酸化蛋白的859個獨特磷酸化位點（支持信息，表S5）。進一步分析確定的磷酸化位點，我們發(fā)現(xiàn)磷酸化絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）和酪氨酸（Y）的分布分別為52.39%、35.04%和12.57%。蘇氨酸（T）和酪氨酸（Y）磷酸化的明顯較高比率表明SEVs磷酸化蛋白質(zhì)組中可能存在不同的激酶和信號通路。我們利用iGPS軟件分析了磷酸根周圍的位置特異性氨基酸，進一步研究了激酶與底物的相關性。如圖6所示，激酶CAMK、STE20、STKR、MAPK和CDK是最受歡迎的，這與先前報道的結(jié)果一致，即CAM激酶IIα和STE20激酶SPAK和OSR1是通過SEVs在細胞之間移動的候選貨物蛋白。此外，最近的研究表明，在許多癌癥如前列腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了高水平的不同類型的CAMK，尤其是CAMKII。因此，SEVs在轉(zhuǎn)運潛在的異常激酶和底物方面所起的重要作用使其成為新藥靶點發(fā)現(xiàn)和腫瘤監(jiān)測的重要來源。 

圖6 血清SEVs磷酸蛋白質(zhì)組中最豐富的10種激酶

方案2 “一種材料”富集血清SEVs磷酸化蛋白質(zhì)組的過程

總之，我們開發(fā)了一種新的血清SEVs磷酸化蛋白質(zhì)組富集和鑒定方法。通過金屬離子與SEVs表面磷酸基團之間的螯合作用和靜電相互作用，采用GFST方法可以實現(xiàn)高效、選擇性的SEVs分離。利用GFST對磷酸肽進行高度相容的串聯(lián)富集可以顯著減少樣品損失和處理時間，并且僅使用低微克的蛋白質(zhì)就可以提高SEVs磷酸蛋白質(zhì)組的覆蓋率。