編譯：草重木雪，編輯：Tracy、江舜堯。

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導(dǎo)讀

后發(fā)酵普洱茶（PFPT）是一種具有獨(dú)特感官特性和多種保健功效的微生物發(fā)酵茶。曲霉是PFPT發(fā)酵的優(yōu)勢真菌，也是PFPT發(fā)酵特性的主要貢獻(xiàn)者，其潛在的功能值得深入研究。我們分別用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)方法分析了茶葉在Aspergillus niger、Aspergillus tamarii和Aspergillus fumigatus發(fā)酵所得樣品(命名為Asn、Ast和Asf)。我們觀察到曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的類黃酮，甘油磷脂，有機(jī)氧化合物和脂肪酸的組成發(fā)生了變化。我們鑒定了用于降解纖維素，淀粉，木質(zhì)素，果膠，木聚糖和木葡聚糖的碳水化合物活性酶，例如內(nèi)切葡聚糖酶和纖維素酶，還鑒定了糖苷水解酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、單寧酶、漆酶、香草醇氧化酶和苯醌還原酶，并推測它們可以催化酚類化合物的水解、氧化、聚合和降解?？偨Y(jié)來看，曲霉可以產(chǎn)生改變茶葉中代謝產(chǎn)物濃度和組成的酶。

論文ID

原名：Integrated proteomics and metabolomics analysis of tea leaves fermented by Aspergillus niger, Aspergillus tamariiand Aspergillus fumigatus譯名：茶葉經(jīng)Aspergillusniger、Aspergillus tamarii和Aspergillus fumigatus發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的綜合分析（普洱茶研究）

期刊：Food Chemistry

IF：6.306發(fā)表時(shí)間：2020.07通訊作者：趙明；潘映紅

通訊作者單位：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)；中國農(nóng)科院

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 代謝組學(xué)結(jié)果

在原理成分分析（PCA）得分圖中，質(zhì)量控制（QC）樣品被聚類在一起，這表明該方法具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。真菌發(fā)酵樣品（Asn，Ast和Asf）與未接種的發(fā)酵樣品（CK）的差異聚類，表明真菌發(fā)酵改變了茶葉中的代謝產(chǎn)物。Asf和Ast重疊，并與Asn分離，表明Asf和Ast中檢測到的代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，但與Asn中的代謝產(chǎn)物可區(qū)分（圖1A）。與Asn-CK，Ast-CK和Asf-CK相比，55、116和107種代謝物的相對峰面積（PA）顯著降低（VIP> 1.0，p <0.05和FC <0.66），包括1，42和30種代謝物的相對PA下降超過10倍。90、89和106個(gè)代謝產(chǎn)物的相對PA顯著增加（VIP> 1.0，p <0.05和FC> 1.5），其中64、61和71個(gè)代謝產(chǎn)物的PAs增加>10倍（圖1B）。我們總共鑒定出281種差異代謝物（DCM），例如沒食子酸，槲皮素和3-葡萄糖沒食子酸，這些DCMs分為脂質(zhì)和脂質(zhì)類分子（108種代謝物），苯丙烷和聚酮化合物（76種代謝物），苯類化合物（22種代謝物），有機(jī)氧化合物（22種代謝物），有機(jī)酸和衍生物（21種代謝物）和其他。DCMs進(jìn)一步分為類黃酮（67種代謝物），甘油磷脂（41種代謝物），有機(jī)氧化合物（21種代謝物），脂肪酸（20種代謝物），羧酸和衍生物（19種代謝物），苯和取代的衍生物（16種代謝產(chǎn)物），異戊二烯醇脂質(zhì)（15種代謝物），甘油脂（14種代謝物）等（圖1C）。因此，非靶向的代謝組學(xué)分析可檢測曲霉發(fā)酵后的類黃酮，甘油磷脂，有機(jī)氧化合物，脂肪?；鹊幕钴S代謝，這與普洱茶的工業(yè)發(fā)酵一致，然后應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)分析來識(shí)別導(dǎo)致這些代謝變化的酶。 

圖1 代謝組學(xué)分析結(jié)果

（A）在質(zhì)量控制樣品（QC），對照未發(fā)酵茶（CK）和經(jīng)A. niger（Asn），A. tamarii（Ast）和A. fumigatus (Asf)發(fā)酵的茶葉中檢測到的峰面積的主成分分析（PCA）。（B）比較Asn-CK，Ast-CK和Asf CK之間差異變化的代謝物（DCM）相對峰面積的倍數(shù)變化（FC）分布。（C）DCM的分類。

2.  蛋白質(zhì)組學(xué)

493到1632個(gè)蛋白質(zhì)的重復(fù)分析(ProteomeXchange Consortium PXD015798)，在Asn、Asf和Ast中分別鑒定出2035、2210和1095個(gè)獨(dú)特蛋白，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Q12552)、1,3-β-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶(G3Y0U4)，甘肽n-十四酰基轉(zhuǎn)移酶(G3Y8R4)。除未分類的組外，高度代表的GO類包括催化活性和分子功能結(jié)合，生物過程中的細(xì)胞過程和代謝過程，以及細(xì)胞組分的細(xì)胞部分和細(xì)胞成分。69條KEGG通路顯著富集(p < 0.05)，富集程度最高的為“代謝通路”(ko01100)和“次生代謝產(chǎn)物生物合成”(ko01110)。排除了全局通路，這些富集的KEGG通路分為三類:細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理和代謝。富含“新陳代謝”的KEGG途徑進(jìn)一步分為“氨基酸代謝”，“碳水化合物代謝”，“脂質(zhì)代謝”，“輔因子和維生素代謝”，“其他氨基酸代謝”，“能量代謝”，“聚糖的生物合成和代謝”，“核苷酸代謝”以及“萜類和聚酮化合物的代謝”。屬于“脂質(zhì)代謝”的六個(gè)大量富集的KEGG途徑，包括α-亞麻酸代謝（ko00592），甘油磷脂代謝（ko00564），甘油脂代謝（ko00561），酮體的合成和降解（ko00072），脂肪酸降解（ko00071）和脂肪酸生物合成（ko00061），可以解釋“脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子”中代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化，其中包括甘油磷脂(41種代謝物)、脂肪酸(20種代謝物)、丙烯醇類脂類(15種代謝物)、甘油脂類(14種代謝物)、甾醇類脂類(8種代謝物)、類固醇及其衍生物(6種代謝物)和鞘脂類(4種代謝物)。KEGG途徑的其他富集屬于“氨基酸代謝”和“氨基酸的代謝”，可能會(huì)導(dǎo)致氨基酸，肽和類似物的水平變化（17種代謝物）?？偟膩碚f，大多數(shù)被鑒定的蛋白質(zhì)屬于細(xì)胞過程或代謝過程，并在屬于代謝的途徑中富集，這支持真菌的生長和繁殖，也導(dǎo)致發(fā)酵茶葉中主要代謝產(chǎn)物的水平變化，如氨基酸和脂類?？偟膩碚f，大多數(shù)被鑒定的蛋白質(zhì)屬于細(xì)胞過程或代謝過程，并在屬于代謝的途徑中富集，這支持真菌的生長和繁殖，也導(dǎo)致發(fā)酵茶葉中主要代謝產(chǎn)物的水平變化，如氨基酸和脂類。

3.  碳水化合物:茶葉中碳水化合物的活性酶和代謝

CAZymes是指涉及糖或糖衍生物生物轉(zhuǎn)化的大量催化活性，這些催化活性將單糖組裝成寡糖或多糖，以及與核酸，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，多酚和其他化合物結(jié)合。它們負(fù)責(zé)碳水化合物的合成（通過糖基轉(zhuǎn)移酶[GTs]），降解（糖苷水解酶[GHs]，多糖裂解酶[PLs]，碳水化合物酯酶[CEs]，輔助活性酶[AAs]）和碳水化合物識(shí)別（碳水化合物結(jié)合模塊[CBM]）。曲霉基因組具有廣泛的CAZymes，例如黑曲霉CBS513.88包含176個(gè)預(yù)計(jì)編碼CAZymes的基因。在這項(xiàng)研究中，Asn，Asf和Ast蛋白質(zhì)組中的232、205和226酶分別標(biāo)注到CAZy數(shù)據(jù)庫中的103、86和97項(xiàng)中，包括所有六個(gè)家族：GH，GT，AA，CE，PL和CBM。家族成員最多的是GH3（24個(gè)蛋白），GH28（20個(gè)蛋白），GH18（14個(gè)蛋白），GH31（13個(gè)蛋白），GH16（11個(gè)蛋白），GH7（11個(gè)蛋白），GH2（11個(gè)蛋白）（圖2A），AA7（21個(gè)蛋白質(zhì)），AA3_2（11個(gè)蛋白質(zhì)），AA3_3（9個(gè)蛋白質(zhì)）（圖2B），CE10（30個(gè)蛋白質(zhì)），CE8（10個(gè)蛋白質(zhì)），PL1_4（18個(gè)蛋白質(zhì)（圖2C），GT4（17個(gè)蛋白）和CMB1（11個(gè)蛋白）。通過代謝組學(xué)分析，我們鑒定出50種糖苷，其中大部分為糖苷（22種代謝物），葡糖醛酸苷（7種代謝物）和吡喃葡萄糖苷（5種代謝物）。與CK相比，Asn，Ast和Asf中9個(gè)，26個(gè)和22個(gè)糖苷的相對水平降低（VIP> 1.0，p <0.05和FC <0.66），而13，19和15個(gè)糖苷的相對水平增加（VIP>1.0，p<0.05和FC>1.5）。由于GH（EC 3.2.1-）和GT（EC 2.4.x.y）分別催化糖苷鍵的水解和形成，因此它們的水平似乎因其對發(fā)酵茶葉中糖苷的作用而改變，例如，34個(gè)葡糖苷酶和一種UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶被鑒定，它們可能參與了糖苷和吡喃葡萄糖苷的代謝；α-葡萄糖醛酸苷酶，β-葡萄糖醛酸苷酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶可能會(huì)水解葡萄糖醛酸苷；α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，龍膽二糖酶和鼠李糖苷酶可能分別水解半乳糖吡喃糖苷，半乳糖苷，龍膽苷和鼠李糖苷。

根據(jù)先前對曲霉中CAZymes的分析，在本研究中我們鑒定了屬于35個(gè)CAZymes家族或亞家族的119種蛋白質(zhì)，并假設(shè)它們可降解植物多糖，包括纖維素，淀粉，木質(zhì)素，果膠，木聚糖和木葡聚糖。內(nèi)切葡聚糖酶，α/β-葡萄糖苷酶和纖維素酶可能參與纖維素的降解。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶降解淀粉。過氧化物酶屬于AA2和裂解多糖單加氧酶（LPMO）家族，葡萄糖-甲醇膽堿氧化還原酶，葡萄糖氧化酶，醇氧化酶和半乳糖氧化酶參與木質(zhì)素的降解。果膠裂解酶，果膠裂解酶，鼠李糖半乳糖醛酸裂解酶，聚半乳糖醛酸酶，內(nèi)聚半乳糖醛酸酶，α-L-鼠李糖苷酶和果膠酯酶作用于果膠骨架，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和內(nèi)-β-1,4-半乳糖苷酶可能作用于果膠的毛狀區(qū)域的側(cè)鏈；Endo-1,4-β-木聚糖酶，木糖苷酶和半乳糖苷酶能夠降解木聚糖和木葡聚糖；植物多糖的降解會(huì)溶解茶葉細(xì)胞壁并導(dǎo)致茶葉軟化。我們觀察到PFPT發(fā)酵過程中茶葉軟化的現(xiàn)象以及以前的報(bào)告支持了這一點(diǎn)，該研究表明茶葉的表面被微生物覆蓋，并且它們的細(xì)胞結(jié)構(gòu)很大程度上在發(fā)酵后破壞。在最近的一份報(bào)告中，我們還確定了可能參與普洱茶工業(yè)發(fā)酵中茶糖代謝的CAZymes，因此，曲霉菌在普洱茶發(fā)酵中的作用似乎是產(chǎn)生CAZymes，其參與糖苷和多糖的代謝以及寡糖的產(chǎn)生，然后負(fù)責(zé)普洱茶的醇香口味。

圖2 碳水化合物活性酶的注釋

（A）糖苷水解酶[GHs]。（二）輔助活動(dòng)[AAs]。（C）碳水化合物酯酶[CEs]和多糖裂解酶[PLs]。（D）糖基轉(zhuǎn)移酶[GTs]和碳水化合物結(jié)合模塊[CBM]。圓直徑表示分配給每個(gè)家族的酶的數(shù)量。藍(lán)，綠，藍(lán)和紅線分別表示在由黑曲霉（Asn），塔氏曲霉（Ast）和煙曲霉（Asf）發(fā)酵的樣品中鑒定的酶。

4.  茶酚類化合物代謝中涉及的酶

多酚（主要是兒茶素）是茶的特征，已顯示出許多健康益處，例如減少冠心病，糖尿病和癌癥的發(fā)生率，此外，兒茶素的氧化在發(fā)酵過程中產(chǎn)生聚合物產(chǎn)品對于茶的感官質(zhì)量至關(guān)重要。在這項(xiàng)研究中，我們鑒定出77種多酚和22種苯甲酸鹽，它們可以歸類為酚類化合物，包括（±）兒茶素，沒食子酸和槲皮素。這些化合物可進(jìn)一步分為酚類糖苷（38代謝產(chǎn)物），酚酸酯，包括11種沒食子酸酯和1種咖啡酸酯，酚酸（12種代謝物）等。與CK相比，Asn，Ast和Asf中18、53和48種酚類化合物的相對含量分別顯著降低（VIP> 1.0，p <0.05和FC <0.66）。此外，它們中的29、40和36有所增加（VIP>1.0，p<0.05和FC>1.5）。如上所述，酚類糖苷被GH降解，例如，葡糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，半乳糖苷酶和鼠李糖苷酶。此外，曲霉發(fā)酵后，一種或多種樣品（如飛燕草素3-咖啡酰葡糖苷）中的8種黃酮-3-O-糖苷，4種黃酮-7-O-糖苷和一種黃酮8-C-糖苷的相對水平增加。GT1家族中注釋了7種酶（B8NGA8，Q5AZU6，A0A1F7ZJI4，A0A1M3TYR2，A0A3F3RCY7，A0A0U5C128和A0A1L9WXZ2），并顯示出與UDP-葡萄糖醛糖基轉(zhuǎn)移酶或UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的同源性。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫的注釋，GT1包括黃酮醇3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（EC 2.4.1.91），花青素3 O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（EC 2.4.1.115），花青素3-O半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（EC 2.4.1.-）和黃酮-8-C-糖基轉(zhuǎn)移酶，因此，我們推測GT1家族的這些酶參與了類黃酮糖苷的合成，從而導(dǎo)致其水平升高。

我們鑒定出11種沒食子酸酯，例如（-）-兒茶素沒食子酸酯，兒茶素3-O-gallate，表沒食子兒茶素沒食子酸酯和3-葡萄糖沒食子酸并顯示水平下降，而2-肉桂?；?1,6-二對戊二酰基β-D-吡喃葡萄糖的含量增加了。CEs是催化取代糖的O-或N-去?；拿?；單寧酶（E.C：3.1.1.20）是一種CE，可催化水解單寧酸（如單寧酸）中酯鍵的分解，從而產(chǎn)生沒食子酸和葡萄糖。通過dbCAN注釋，我們鑒定出57個(gè)CE，并將其分配給CE1，CE4，CE5，CE8，CE10，CE12和CE16家族，其中最多的是CE10（30種蛋白質(zhì)）和CE8（10種蛋白質(zhì)）（圖2C）。另外，通過UniProt注解鑒定出28種羧酸酯酶。我們手動(dòng)檢查UniProt中的注釋，鑒定出單寧酸酶，包括Asn、Ast和Asf中六個(gè)（A0A100IAT1，A0A146F2H6，A0A1L9N5Y7，A0A1M3T559，A0A1R3RGG8和G3YCQ1），四個(gè)（A0A0L1J7V2，A0A1L9N5Y7，A0A1S9DXC9，Q000I5），3個(gè)（A0A1L9N5Y7, A0A1S9DKA2，Q000I5）。其中鞣酸酶可以水解沒食子酸酯并釋放出酚酸，這可以解釋這些化合物的不同濃度。沒食子酸酯的水解是減少普洱茶澀味的原因。

AAs是與CAZymes結(jié)合起作用的氧化還原酶。在本研究中，我們將Asn，Asf和Ast中的26、26和34個(gè)酶分別注釋為AAs的7個(gè)，8個(gè)和10個(gè)亞家族（圖2B）。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫中的注釋，AA1酶是多銅氧化酶，使用雙酚和相關(guān)物質(zhì)作為供體，氧作為受體。在這項(xiàng)研究中，我們將5種蛋白質(zhì)分配給AA1（A0A117E1I5，A0A1M3T7I9，A0A1F7ZZD2，A0A1F7ZZD2和A0A1L9UZX1），它們與漆酶具有同源性（表1）。漆酶(苯二醇:氧氧化還原酶，EC 1.10.3.2)屬于多酚氧化酶家族，催化多種酚類底物的聚合，如兒茶素、兒茶酚、沒食子酸、阿魏酸、丁香醛、香草醛、乙酰香草醛、針葉醇和蘆丁。AA4（香草醛醇氧化酶）催化芳香環(huán)對位上帶有側(cè)鏈的多種酚類化合物的轉(zhuǎn)化。兩種酶（A0A1L9N8M8和A0A1L9TBF2）被確定為屬于AA4家族，與香草醛醇氧化酶相似。據(jù)報(bào)道，香草醛醇氧化酶可催化多種對位取代的酚類化合物的氧化，包括A0A1L9NCG6和A0A1F8A287在內(nèi)的兩種酶被分配到AA6家族，與苯醌還原酶相似（表1）。苯醌還原酶催化醌還原為對苯二酚，并參與芳香族化合物的生物降解和保護(hù)真菌細(xì)胞免受反應(yīng)性醌類物質(zhì)的侵害，因此，本研究中鑒定的漆酶，香草醛醇氧化酶和苯醌還原酶可能參與了多酚和苯類化合物的氧化，轉(zhuǎn)化和生物降解，并導(dǎo)致多酚含量的減少和茶黃素的含量增加；多酚的減少導(dǎo)致澀味的減少和醇厚的味道的增加；茶黃素的增加是棕紅色茶的注入和健康益處的原因；對于茶黃素，可通過調(diào)節(jié)腸道菌群和膽汁酸代謝來減輕高膽固醇血癥。 

圖3 可能參與糖苷水解或合成的糖苷水解酶[GHs]和糖基轉(zhuǎn)移酶[GTs]，其相對水平的變化顯示為Asn-CK，Ast-CK和Asf-CK比較之間糖苷相對峰面積的倍數(shù)變化（FC）的熱圖

圖4 降解植物多糖的酶

包括木質(zhì)素，淀粉，纖維素，果膠，木聚糖和木葡聚糖

圖5 參與茶酚類化合物代謝的酶

表1 可以代謝酚類化合物的酶

我們推測茶多酚和苯類化合物的代謝會(huì)導(dǎo)致其相對水平的變化，其催化作用如下：（1）通過GHs或GTs水解或合成酚糖苷；（2）將鞣酸酶水解酚酯，生成酚酸。（3）酚類化合物被漆酶和香草醇氧化酶氧化或聚合；（4）苯醌還原酶降解了酚類化合物中的芳環(huán)（圖5）。因此，曲霉菌在普洱茶發(fā)酵中的另一個(gè)作用是產(chǎn)生GHs，GTs，鞣酸酶，漆酶，香草醇氧化酶和苯醌還原酶，它們催化酚類化合物的水解，氧化，轉(zhuǎn)化和生物降解。以前的報(bào)告描述了普洱茶工業(yè)發(fā)酵中酚類化合物的代謝網(wǎng)絡(luò)。目前對純培養(yǎng)發(fā)酵樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，不僅驗(yàn)證了GH，GT和鞣酸酶的存在，而且還鑒定了漆酶，香草醛醇氧化酶和苯醌還原酶。Lee等報(bào)道了從普洱茶茶葉中分離出來的由曲霉產(chǎn)生的漆酶可以將EGCG氧化成游離兒茶素，酯兒茶素，沒食子酸和茶色素。在最近的一份報(bào)告中，我們證實(shí)了黑曲霉生產(chǎn)鞣酸的過程及其在茶葉中沒食子酸酯的水解作用。因此，以前的報(bào)告證實(shí)了GH，GT，鞣酸和漆酶的存在，以及漆酶的氧化作用和鞣酸的水解作用。其他酶的存在和催化作用需要進(jìn)一步研究。

結(jié)論

A. niger，A. tamarii，A. fumigatus接種到茶葉中，實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)發(fā)酵。真菌蛋白質(zhì)和茶代謝產(chǎn)物的變化使用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)綜合分析進(jìn)行了表征。我們鑒定了可以降解植物多糖的CAZymes，包括纖維素，淀粉，木質(zhì)素，果膠，木聚糖和木葡聚糖，確定了可以催化酚類化合物水解，氧化，聚合，轉(zhuǎn)化，生物合成和降解的酶。這種純培養(yǎng)物的發(fā)酵分析表明，曲霉菌在PFPT發(fā)酵中的功能是（1）產(chǎn)生CAZymes來代謝糖苷和多糖，并有助于普洱茶的醇香口感。（2）產(chǎn)生GH，GT，鞣酸，漆酶，香草基醇氧化酶和苯醌還原酶來水解，氧化，轉(zhuǎn)化和生物降解茶葉中的酚類化合物，降低多酚的含量并增加茶黃素的含量，這是導(dǎo)致澀味的減少和醇厚味道的增加，以及棕紅色茶的注入以及普洱茶的健康益處的原因。這些發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了對曲霉的功能的認(rèn)識(shí)，形成了獨(dú)特的感官特征和有益健康的PFPT。原文鏈接：  https://pubmed.ncbi.nlm./32711271/