RNA-蛋白之間的相互作用調節(jié)RNA生命的整個過程，從轉錄到成熟、轉運、定位以及降解。RNA和RBPs之間動態(tài)的相互作用形成了功能型的核糖核蛋白（RNP），隨后實施廣泛的細胞功能。掌握RNAs和RBPs之間內在的聯系對于理解RNA調節(jié)細胞生理至關重要。的確，RNA-蛋白之間相互作用的異常調節(jié)在一系列疾病中非常重要，包括脊髓性肌肉萎縮癥、肌萎縮性側束硬化癥以及一系列腫瘤，對于基于核酸的療法可作為前景的靶向。不幸的是，對這種相互作用從無差別的全系統景觀描述方法的缺乏限制了對細胞內穩(wěn)態(tài)方面的探究。研究者近期開發(fā)的OOPS方法能夠解決這個不足，以無差別的方式全面的分析RNA結合蛋白組。OOPS結合UV交聯來固定RNA-蛋白之間的相互作用，利用AGPC（又稱為TRIzol）提取富集RNA-蛋白加合物。在正常的AGPC提取條件表，未交聯的RNA分割到了最上層的水相，而未交聯的蛋白分割到了最底下的有機相。交聯的RNA-蛋白加合物同時具有RNA和蛋白質的物理化學特性，因此停滯在中間層并且通過AGPC分離的重復操作富集。富集的蛋白結合RNAs（PBRs）或者RBPs通過酶消化恢復（圖1）。

圖1 OOPS工作流程圖細胞被UV交聯（254nm），RNA、蛋白質以及RNA-蛋白質加合物依據它們的物化特性被分離。RNA結合的蛋白質或者蛋白結合的RNA可能被重新消化加成物的相應部分，RNA以線條展示，蛋白以實心表示。

OOPS直接應用到任何能夠接受UV交聯的生物系統，獨立于RNA的聚腺苷酸狀態(tài)，因此適用于研究非編碼RNA-蛋白之間的相互作用以及原核生物的RBP組學。此外考慮到低產量的需求以及可靠性，OOPS能夠結合多個蛋白組學定量的技術來闡釋在動態(tài)條件下RBP的突變體。

1. 技術的發(fā)展

OOPS技術的發(fā)展在Queiroz等人的研究中有詳細的報道。為了解釋OOPS在恢復RBPs時任何可能的差別，研究者將UV交聯、AGPC分離后的中間層進行了RNA測序，并且發(fā)現全長(>200核苷酸)的轉錄組是結合蛋白質的，提示在任意特定的RNA種系中都是無差別的。從蛋白質的角度，該方法的特異性可通過細胞培養(yǎng)過程中氨基酸穩(wěn)定同位素標記(SILAC)對蛋白組學定量進行檢測。研究者發(fā)現UV交聯能夠提高中間蛋白質的豐度，并且中間位置重復的AGPC分離更加富集了UV交聯的蛋白。為了特異性的恢復中間與RNA相互作用的蛋白，研究者利用RNases處理了中間層，在接下來的相分離中恢復的蛋白質釋放到了有機相。顯著的是，中間層超過95%的蛋白是對RNase敏感的，這充分的說明RBP組的高度特異性富集。

研究者利用OOPS捕獲胚胎的（HEK293）、腫瘤衍生（U2OS）以及非腫瘤衍生（MCF10A）人類細胞系以及細菌(E. coli)，恢復了原核生物第一個RBPomes，說明了OOPS的多效性。研究者將OOPS應用到動態(tài)的框架，在微管解聚細胞停滯的條件下恢復了整體的蛋白質組和RBP組學。此外，通過比較整體的蛋白組學和RBP組學，研究者可以區(qū)分RNA結合活性的變化是RBP豐度的變化引起的。

2. OOPS方法的應用

OOPS從同一樣本中恢復游離的RNA和蛋白質以及UV交聯的RNA-蛋白加合物。這項技術最明顯的應用是通過RNA測序和基于MS蛋白組學方法從全系統的景觀對這些相互作用進行闡釋。然而，交聯的蛋白質-RNA加合物同樣可能作為更多特異性研究的原材料。結合部分蛋白消化以及基于silica對肽段-RNA加合物的富集，交聯的肽段可被用于確定RNA結合的結構域或者區(qū)域。此外，中間層部分可結合其他技術（如基于CLIP的技術），利用交聯的蛋白質-RNA純化樣本簡化實驗方法。此外，由于OOPS恢復的所有RNA是交聯蛋白知道，可結合基于oligo(dT)的mRNA結合蛋白恢復方法，捕獲RNA相互作用組（RIC）以從非編碼的RNA結合蛋白中區(qū)分mRNA結合蛋白質。

3. 與其他方法的比較

RBPs的高通量確定由基于RIC的方法確定，RIC已經證實對不同真核生物系統中RBPs的分類是有用的，但是對聚腺苷酸化的RNA結合蛋白是明顯有偏差的，當聚腺苷酸化RNA缺乏時妨礙了對RBPs的全面分類或者應用。利用UV交聯和相分離來分離RBPs的選擇性方法有XRNAX和PTex，盡管這三種方法有一些重要的差異。OOPS需要的原始材料最少(對于人類細胞：OOPS ~3 × 106, PTex ~5 × 106，XRNAX ~8 ×107)。由于并未進行直接的比較，每種方法相對的優(yōu)勢和劣勢不能確定。

4. 實驗設計

OOPS的開發(fā)有兩個目的：為了對任意生物體內RBPs進行全面的分類以及研究RBP組的動力學。目前已經應用到真核和原核細胞，黏連的和非黏連的細胞培養(yǎng)以及有無細胞壁的細胞。典型的OOPS實驗包括UV放射形成蛋白-RNA加合物、細胞裂解、相分離重復以富集加合物以及蛋白質或者RNA的恢復。在不同的生物系統中所有的修飾都需要實施到實驗方法，同樣重要的OOPS步驟在圖2中做了詳細的說明。

圖2 OOPS工作流程圖示方法的步驟和完成時間結合OOPS中RNA和蛋白的圖解形式展示，同時在右側對步驟有一個簡要介紹。完成每一步的時間依據細胞的類型（步驟1-3）以及短時或者過夜消化的選擇（步驟69-90以及91-101）。

5. 原始材料

通常，在中間層包含更多物質時OOPS更易操作。中間層的物質依賴于原始材料的質量、RNA-蛋白質交聯的效果以及細胞裂解的成分，如需要在實驗過程中優(yōu)化補充。過量體積的中間物對于分解、純化以及消化是困難的。當在一種新的物種或者組織中進行OOPS，UV劑量和原始材料需要優(yōu)化。此外，在含細胞壁的個體中，以RNA或者蛋白質兼容的方式進行細胞裂解需要優(yōu)化。

6. 對照

OOPS的模塊化允許合并不同的對照提高確定的RBPs或者RNA結合中變化的可靠性。當在新的生物模型中對RBPs進行分類時，優(yōu)先使用SILAC的對照。將SILAC標記UV交聯的細胞或者未交聯的細胞、細胞裂解階段的混合樣本經OOPS富集的蛋白質豐度進行比較，是對RBPs分類的經典方法（圖3）。對照組在一定程度上評估了利用OOPS進行蛋白分離是依賴UV的。OOPS在生物學重復組中保持一致的RNA量。因此，可利用SILAC將RNase+/?處理后混合的OOPS中間層進行RNA降解的選擇性對照（圖3）。對照組在一定程度上評估了在最后干凈的中間層蛋白質的出現是依賴于RNA的。對于合并穩(wěn)定同位素編碼氨基酸的生物學系統并不是一個合適的選擇，一個單獨的最終的OOPS中間層可被分裂成RNAse +/?的樣本并且經過無標簽定量LFQ分析，為OOPS富集蛋白質的RNA結合狀態(tài)提供定量的證據，雖然沒有SILAC準確。同樣的，分離的非交聯以及RNase陰性對照的樣本可通過免疫印跡檢測。

圖3 不同SILAC對照與OOPS流程圖示UV交聯以及RNase的SILAC對照可在步驟的對應階段加入，紅色的箭頭代表結合樣本的步驟（步驟3是非交聯的對照，步驟75是RNase陰性的對照）。對于非交聯的對照，在細胞裂解液階段進行混合（上部）。對于RNase陰性對照，在最終相分離之前將清理的中間層混合（下部）。

7. RNA結合蛋白的動態(tài)學

OOPS更易適用于都通過定量比較不同條件下RBPs整合RBP的動態(tài)學。例如基于TMT的分析被應用于闡釋微管解聚細胞停滯條件下RBP的動力學。TMT允許高度復用的能力，降低了質譜分析的時間以及每個樣本在獨立的液相以及串聯質譜(LC?MS/MS)比較中錯失的信息。RBP組學的動力學研究通過同時定量整體的蛋白和RNA結合蛋白的豐度來特異性的確定RNA結合發(fā)生改變的RBPs，與不同豐度下確定RBPs相對（圖4）。從同一樣本中獲取整體的蛋白組學和RBP組學信息建議降低混雜因素和批次效應。實驗框架可補充以研究其他實驗條件下RBP組學的動態(tài)學。當達到三個分析條件時，在不同條件下整體以及RNA結合蛋白的SILAC定量對于TMT定量是容易實施的。

 圖4 TMT實驗設計流程在TMT實驗中加入不同的處理（t），整個蛋白組學可從全部的裂解液中獲得、TMT標記以及與單一樣本結合。不同的RBP組學可獨立獲得、標記并且與第二個樣本結合。

8. MS的技術考慮

OPPS技術是一項高度有效的RBP富集技術，數以百計蛋白的陰性對照不能檢測到信號。當利用SILAC對UV交聯和未交聯的對照進行RBPs相對豐度的定量，一些肽段也僅在交聯樣本中觀察到。研究者因此提示可調整MS背景以檢測SILAC對，以避免MS2錯過這些在交聯樣本中高度富集的肽段。

商業(yè)化可應用的TMT試劑盒相較于RBP富集可標記更多量的肽段。在研究者的項目中，將一個0.80-mg TMT標簽的小瓶等體積分成兩份標記RBPs和整體的蛋白分離物(分別~10?25 μg和15?40 μg)取得了令人滿意的結果。當處理低反應體積的RMT標記，維持TMT標簽和肽段的正確濃度是非常重要的。同樣值得注意的是TMT的定量將低估倍數的變化，利用Orbitrap質譜儀與SPS-MS3可并且保留排除的肽譜與共分離的證據匹配而減弱。

9. 局限性

在變性的條件下所有恢復RNA-蛋白相互作用的方法都需要先穩(wěn)定這些相互作用。目前UV交聯是一種“黃金標準”的方法以零距離共價穩(wěn)定RNA-蛋白之間的相互作用。然而，有報道稱在劑量高于1 J/cm2，UV-C能夠誘導產生單鏈的DNA-蛋白和蛋白-蛋白加合物，這些加合物并不限制在OOPS的中間層，加合物中的一半更傾向于分離到有機層。研究者建議根據選擇的生物系統評估需要UV的最適值（步驟2）。由于OOPS需要RNA-蛋白質之間的相互作用是穩(wěn)定的，因此只適用于能夠接受UV交聯的生物系統。

OOPS可能用于通過同源大分子的酶連水解獲取RNA結合蛋白質組以及蛋白質結合轉錄組。然而結合的轉錄組或者蛋白組保留它們對應的特性，這將影響下游的分析。例如，在蛋白酶消化后，一個或多個氨基酸可能仍然與蛋白結合的轉錄組交聯。殘留的氨基酸干擾一些反轉錄酶，影響cDNA的合成和最終RNA的定量，特別是考慮到全長cDNA。因此需要利用片段RNA進行反轉錄。在交聯位點覆蓋的缺失仍然能被檢測到。影響轉錄的定量。如果研究者想從read覆蓋率的缺失推斷交聯位點，這可能提供了有用的信息。從RBP組學的角度，交聯的蛋白在基于大小的電泳中遷移不同，除非RNA被完全消化。此外，最常見的利用肽段光譜與算法匹配并不能控制過多的氨基酸和核苷酸，結果交聯的肽段不能被直接檢測到。同時這一限制也能作為優(yōu)勢，因為它允許使用定制開放的搜索引擎直接確定交聯的肽段以及蛋白的交聯位點。

最終研究者發(fā)現相分離方法能夠在中間層富集一組多糖蛋白不依賴于它們RNA結合的狀態(tài)。這些多糖蛋白可以利用RNase以及交聯的陰性對照樣本進行確定，但是在數據分析時需要將多糖肽段排除。

10. 預期結果

該方法適用于從同一樣本中恢復蛋白交聯的RNA（步驟46）以及非交聯的RNA（步驟7），以及RNA交聯蛋白（步驟90）和非交聯的蛋白（步驟9）。

在蛋白酶K處理后，在瓊脂糖凝膠或者生物分析對交聯和未交聯RNA的RNA圖譜應該相似（圖5a）。然而由于殘留的氨基酸與RNA相連，核糖體RNA的峰圖區(qū)域更寬。當交聯時微小的峰圖可能在18S一下出現，并不影響轉錄的結果。在未交聯樣本中中間層RNA的數量不代表交聯樣本中間層超過2-5%的RNA（圖5b）。若超過5%的被檢測到，參照“故障檢測”（表1）。

 圖5 OOPS RNA恢復（a）在蛋白酶K消化后，非交聯（NC）和交聯的（CL）樣本水相和中間層典型的生物分析儀RNA圖譜；（b）左側代表1%瓊脂糖凝膠中的圖像發(fā)現主要的核糖體RNA條帶，每個柱中UV的劑量（上部：水相，游離的RNA；下部：中間層，蛋白結合的RNA）；右側利用Nanodrop (n = 3)測量不同UV劑量下RNA交聯的相對比例。

獲取RNP復合體最受限制的步驟之一是對交聯效率的優(yōu)化。交聯效率可能被暴露在不同長度UV下中間層RNA的比例影響。PBR%=中間層RNA的ng/（中間層RNA的ng數+第一個水相中游離的RNA）。

從1 × 107人類貼壁細胞中獲取75%的交聯RNA并且超過10 ug的RBPs，而非交聯的對照組恢復最少（圖6）。人類細胞系中每個OOPS實驗可以檢測到~1,500個結合蛋白，超過10 ug的RBPs。當利用SILAC進行LC?MS/MS分析，研究者不建議檢測SILAC對作為MS2片段的前提。依據這條建議，期盼有三個群體的蛋白：與RNase或者交聯陰性對照比沒有富集的蛋白、與陰性對照比富集的蛋白(RBPs)以及陰性對照中沒有檢測到信號的蛋白（高度富集的RBPs）。OOPS是一種高度有效富集RBP的技術，在陰性對照樣本中通常檢測不到信號。如果與重復組一致，這些蛋白被視為一個RBP。圖7a展現了交聯+/?和RNase +/?實驗中SILAC的比率。

圖6 銀染說明OOPS的不同階段（a）OOPS方法應用于非交聯（CL-）和交聯的（CL+）U2OS細胞中，從以下階段獲得蛋白樣品：分離之前的細胞裂解（inputs）、每個經過三輪TRIzol分離后的有機相（有機相1,2,3）以及RNase和最終TRIzol分離后的有機相（有機相4）。樣本隨著蛋白梯度marker在4-12%的Bis-Tris膠上進行，隨后進行銀染；（b）陽性的RBP對照的免疫印跡(NCL; Nucleolin, 100KDa, PTB; 60KDa；HuR; 36KDa)以及陰性對照蛋白(H3; Histone-H3; 18KDa、β-tubulin; 55 KDa)。

在OOPS中對整體蛋白豐度和RNA結合蛋白豐度平行定量來對不同條件下RBP組學的動態(tài)變化定量時，可以利用線性模型確定RNA結合中發(fā)生重要變化的蛋白。對于大多數生物刺激，感興趣的蛋白將會是那些在整體蛋白豐度上有很小或者沒有變化的蛋白，并且在RNA結合豐度具有可重復性的改變。圖7b展示了之前報道數據中糖酵解途徑蛋白的整體的和RNA結合的豐度。

 圖7 OOPS MS結果（a）利用U2OS進行SILAC交聯(CL) +/? 以及RNase +/?實驗的預期結果。在陰性對照樣本中并未檢測到蛋白信號，與CL或者RNase樣本中的偽值等價。這些偽值代表在CL或者RNase條件下高度富集的蛋白。Log的比率接近0代表蛋白沒有顯著富集，可能是非RNA結合；（b）諾可達唑停滯0 h以及釋放6 h和23 h全部和RNA結合蛋白的豐度。蛋白的豐度是每個樣本的中位值并且與給定樣本中整體蛋白質豐度相對，并且在整體的和RNA結合的定量中可比較。結果顯示了糖酵解信號通路的成員。在停滯和釋放的時間點觀察到RNA結合蛋白的顯著升高。

正交有機相分離的方法（OOPS）是一種快速、有效并且可重復的方法能夠以無差別的方式將交聯的RNA-蛋白加合物進行純化。OOPS避免了分子標簽或者捕獲聚腺苷酸RNA。相反，它是在標準的TRIzol分離到RNA-結合蛋白（RBPs）富集之間取樣并且它們同源結合RNA。OOPS的特異性是通過RNases消化的富集界面或者蛋白酶釋放的RBPs或者蛋白結合RNA分別實現的。在本文中研究者呈現了從同一樣本中純化蛋白-RNA加合物、游離蛋白質以及游離RNA一步步的方法，并且進一步描述了OOPS如何應用到人類細胞、擬南芥、裂殖酵母、大腸肝菌中，以及它如何用來研究RBP的動力學。