在本文中，作者開(kāi)發(fā)了一種基于酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿(AGPC)的正交有機(jī)相分離(OOPS)的方法，用以解決傳統(tǒng)通過(guò)oligo(dT)不能用于細(xì)菌系統(tǒng)的問(wèn)題。傳統(tǒng)通過(guò)oligo(dT)純化RNA，隨后鑒定RNA結(jié)合蛋白R(shí)BPs的方法依賴于poly(A)尾巴，而且純化需要大量原料，使其難以在動(dòng)態(tài)條件下施展拳腳。作者開(kāi)發(fā)的AGPC方法首先通過(guò)UV交聯(lián)獲得穩(wěn)定的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使其保留在有機(jī)相和水相之間的相界面上，再使用蛋白酶K處理即可分別得到交聯(lián)的RNA和蛋白質(zhì)。

   為了確定AGPC方法能否得到RNA交聯(lián)的蛋白質(zhì)，作者設(shè)計(jì)了SILAC標(biāo)記實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。在最初的SILAC實(shí)驗(yàn)中作者在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加了同位素標(biāo)記的氨基酸，輕標(biāo)組使用了UV光進(jìn)行交聯(lián)，重標(biāo)組不做處理，輕重組混合后重復(fù)進(jìn)行相分離以除去非交聯(lián)蛋白，質(zhì)譜鑒定即可得到交聯(lián)蛋白。但這些交聯(lián)蛋白中也包含例如糖蛋白等物理性質(zhì)與RBPs相似的蛋白，僅通過(guò)UV交聯(lián)不足以區(qū)分它們，所以作者設(shè)計(jì)了第二組SILAC實(shí)驗(yàn)，等量的輕重標(biāo)組被相同的進(jìn)行UV交聯(lián)后，重標(biāo)組使用RNase處理，輕標(biāo)組則不作處理，通過(guò)質(zhì)譜即可得到RNase敏感的蛋白質(zhì)。結(jié)合RNase處理，作者認(rèn)為即可得到靠譜的RBPs。

    作者通過(guò)OPPS在U2OS、HEK293和MCF10A細(xì)胞鑒定到了總共1838種蛋白，與先前RBPs研究數(shù)據(jù)比較顯示出了71%的重復(fù)。此外作者還比較了OPPS與非poly(A)依賴性的RICK和CARIC (由北京大學(xué)陳興課題組開(kāi)發(fā))方法純化的蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示出了80%的overlap。這些結(jié)果證明了OOPS可以得到大部分已被證實(shí)的RBPome，包括不結(jié)合含有poly(A)尾巴RNA的蛋白質(zhì)，具有很好的可靠性。

      除了已知的RBPs，OOPS還可以鑒定到許多未知的潛在RBPs，在鑒定RBP及其結(jié)合位點(diǎn)上具有很大的應(yīng)用潛力。