編譯：Jione、song，編輯：小菌菌、江舜堯。

原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。

本研究在常規(guī)飼養(yǎng)和無菌的小鼠上進(jìn)行全基因組亞硫酸氫鹽測序，誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)損傷，評估體重、糞便粘稠度和糞便含血量以及腸潰瘍、隱窩結(jié)構(gòu)喪失和結(jié)腸縮短。誘發(fā)GF小鼠的炎癥反應(yīng)，并以成年的GF小鼠作為糞便移植受體飼養(yǎng)在無菌隔離器中，11周處死。之前，取出組織進(jìn)行組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)和組織學(xué)評分，最后進(jìn)行測序，并對相應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)綠組測序和甲基化數(shù)據(jù)集合，最后進(jìn)行q-PCR分析驗證，利用ATAC分析開放染色質(zhì)。

1 微生物群誘導(dǎo)的基因表達(dá)改變

為了確定共生菌群對腸道上皮中宿主基因轉(zhuǎn)錄的全基因組影響，文中分析了從小鼠結(jié)腸隱窩分離的腸上皮細(xì)胞（IEC）的mRNA轉(zhuǎn)錄組。數(shù)據(jù)分析表明，免疫基因表達(dá)沒有一般性差異，FACS分析表明，在結(jié)腸隱窩IEC制劑中，免疫細(xì)胞的貢獻(xiàn)較低，這表明免疫細(xì)胞浸潤可忽略不計。

主成分分析表明，與三個GF樣品相反，三個CNV重復(fù)樣品之間基本相似。差異基因表達(dá)分析確定了CNV與GF樣品中824個顯著上調(diào)（q≤0.05和≥2倍變化）的基因和358個下調(diào)的基因，表明存在大量微生物控制基因。對358個下調(diào)基因的基因本體論（GO）分析顯示細(xì)胞外基質(zhì)和代謝過程富集。對824個上調(diào)基因的通路分析顯示，參與有絲分裂細(xì)胞分裂的基因高度豐富，與先前研究表明GF腸細(xì)胞的隱窩更新率降低是一致的。與此發(fā)現(xiàn)一致，增殖標(biāo)志物在CNV隱窩中顯示出明顯增加的表達(dá)水平。總之，本結(jié)果清楚地表明，IECs暴露于細(xì)菌會顯著影響腸道上皮細(xì)胞生物學(xué)的多個方面。

圖1 從GF中分離的結(jié)腸隱窩細(xì)胞與CNV小鼠的WGBS比較

2 微生物群在調(diào)節(jié)元件上引起深刻的表觀遺傳變化

為了確定微生物群對宿主DNA甲基化的全基因組影響，對結(jié)腸隱窩IEC進(jìn)行了全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS）。數(shù)據(jù)分析表明，與GF相比，CNV樣品中的總體甲基化水平顯著降低（圖1a和圖2a）。CNV樣本包含約93000個LMR，而GF樣本僅包含約57000。進(jìn)一步的分析表明，從CNV小鼠中分離出的結(jié)腸隱窩IEC（低甲基化LMR）中，有12983個LMR的甲基化水平降低，而甲基化水平（超甲基化LMR）中只有3115個甲基化水平升高（圖1b）。最終結(jié)果表明，暴露于微生物群會在諸如LMRs的調(diào)控元件上引起深刻的表觀遺傳變化。

由于LMRs提供了使DNA甲基化變化與基因表達(dá)變化重疊的機(jī)會，因此本研究專注于基因內(nèi)LMRs。結(jié)果顯示與基因表達(dá)變化相關(guān)的大多數(shù)LMR都經(jīng)歷了低甲基化。進(jìn)一步研究300個LMR發(fā)現(xiàn)，這些LMR在CNV小鼠中被低甲基化并顯示出明顯的（q≤0.05）表達(dá)增加，因為這種關(guān)聯(lián)被認(rèn)為是甲基化對基因表達(dá)的直接影響（圖1c）。值得注意的是，這些低甲基化的LMRs僅對三個轉(zhuǎn)錄因子家族（FoxA，Eklf和AP1）的結(jié)合位點(diǎn)表現(xiàn)出高度豐富的富集作用-暗示這組轉(zhuǎn)錄因子與微生物群相關(guān)信號的整合有關(guān)（圖1d）。確實，FoxA和Eklf轉(zhuǎn)錄因子在腸道發(fā)育，形態(tài)和體內(nèi)平衡中起著重要作用，而AP1轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞增殖，分化，炎癥，轉(zhuǎn)化，細(xì)胞遷移和凋亡中至關(guān)重要。

CNV小鼠中上調(diào)的300個基因富含GO術(shù)語“小鼠結(jié)腸炎”，“人類炎性腸病”和“人類衰老”（圖1e）。對這三類基因的上調(diào)基因的研究表明，暴露于共生微生物區(qū)會導(dǎo)致LMR脫甲基化和“早期”一組炎癥基因的轉(zhuǎn)錄激活，這很可能會導(dǎo)致正常的腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)。這組基因包括IFITM3（2.9倍），NOS2（15.6倍，）和PLA2G2A（15.5倍），而且這些都是微生物引起的，并參與抗菌和抗炎反應(yīng)。

3 CNV小鼠的急性結(jié)腸炎會誘發(fā)DNA甲基化不足

右旋糖酐硫酸鈉（DSS）的使用會改變腸道粘液層，并允許細(xì)菌在12小時內(nèi)滲透到內(nèi)層。本文使用DSS處理小鼠以增強(qiáng)IECs對微生物群的暴露。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DSS處理的小鼠表現(xiàn)出腸損傷和炎癥的各種癥狀（圖2a-f）。然后，使用WGBS分析DSS相關(guān)的DNA甲基化變化。結(jié)果表明，在經(jīng)DSS處理的CNV樣品中，總體甲基化水平降低（圖2g，圖3b，c），特別是在椎板相關(guān)區(qū)域（LAD）中（圖3d）。這些發(fā)現(xiàn)表明，單劑量DSS-甲基化組的特征在于與后期復(fù)制結(jié)構(gòu)域（部分甲基化結(jié)構(gòu)域（PMD））相關(guān)的大的低甲基化區(qū)域。與活性基因相關(guān)聯(lián)的峽谷的超甲基化是慢性發(fā)炎的腸上皮細(xì)胞的關(guān)鍵特征，但無法檢測到，這表明在急性炎癥條件下，這并不是IEC甲基化組的整體特征。

WGBS和RNA測序數(shù)據(jù)集的整合分析確定了251個啟動子，這些啟動子改變了其甲基化水平并顯著改變了相關(guān)基因的表達(dá)水平（≥2倍）。值得注意的是，大多數(shù)這些基因在經(jīng)DSS處理的CNV小鼠中被激活，并帶有在急性炎癥中經(jīng)歷低甲基化的啟動子。有趣的是，途徑分析表明，上調(diào)的低甲基化基因?qū)τ诿庖呒?xì)胞趨化作用和炎癥反應(yīng)是重要的功能類別，具有豐富的功能。RNA-seq顯示，在DSS樣本中，免疫細(xì)胞的貢獻(xiàn)較低，這表明觀察到的基因表達(dá)變化可能是由于IECs的表觀遺傳重構(gòu)。最終，185個基因集在結(jié)腸炎和結(jié)腸癌GO中得到了富集，這可能提供表觀遺傳變化，炎癥和癌癥之間的機(jī)制聯(lián)系。

圖2 急性炎癥中的甲基化改變影響基因表達(dá)

4 急性結(jié)腸炎在表觀遺傳調(diào)控元件上引起深刻變化

進(jìn)一步分析了LMR甲基化水平顯示，在131133個LMR中，有20061個在CNV/DSS樣品中被超甲基化（甲基化差異>0.1），而14585個被低甲基化。當(dāng)從分析中排除分化相關(guān)的LMRs28時，獲得了高度相似的結(jié)果（圖2h），表明分化相關(guān)的LMRs28對炎癥誘導(dǎo)的甲基化變化沒有顯著貢獻(xiàn)。炎癥相關(guān)的甲基化變化通常會在LMR的整個長度上延伸（圖2i）。此外，隱馬爾可夫模型揭示了針對引發(fā)的、活性的和基因內(nèi)的增強(qiáng)子區(qū)段的一致的DSS依賴性低甲基化。最后，差異甲基化的LMRs明顯富含富集的染色質(zhì)標(biāo)記H3K4me1和H3K27ac，而強(qiáng)烈缺失了活性啟動子標(biāo)記H3K4me3（圖2j）?？傊?，這些結(jié)果表明，急性炎癥在推定的增強(qiáng)子區(qū)域誘導(dǎo)了深刻的表觀遺傳變化。進(jìn)一步的分析確定了373個基因的子集，其表達(dá)顯著增加（q≤0.05），并且在DSS處理的CNV小鼠中LMR甲基化程度降低。這些基因顯示出明顯豐富的免疫應(yīng)答途徑（圖2k），而181個表達(dá)水平降低的低甲基化LMR沒有顯示出GO富集。

與差異表達(dá)基因相關(guān)的LMRs對各種預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)表現(xiàn)出高度顯著的富集，包括兩個炎癥反應(yīng)的范式因子：NF-κB和AP1（圖2l，m）。NF-κB結(jié)合位點(diǎn)在與上調(diào)基因相關(guān)的低甲基化LMR中富集了3.4倍，在與下調(diào)基因相關(guān)的低甲基化LMR中富集了5.5倍，這與NF-κB作為轉(zhuǎn)錄激活因子和阻遏物的雙重功能一致。對于高甲基化的LMR，未觀察到可比的富集，這與選擇性炎癥誘導(dǎo)的NF-κB與低甲基化的LMRs的結(jié)合一致。對于AP1結(jié)合位點(diǎn)，觀察到甚至更強(qiáng)的作用，其在與上調(diào)基因相關(guān)的低甲基化LMR中富集11.3倍，在與下調(diào)基因相關(guān)的低甲基化LMR中富集8.8倍。同樣，對于高甲基化的LMR，沒有觀察到富集。在含有NF-κB或AP1結(jié)合位點(diǎn)的LMR處，DSS誘導(dǎo)的低甲基化現(xiàn)象明顯并延伸到LMR的整個長度上。因此，由粘膜屏障破壞引起的急性炎癥在增強(qiáng)子區(qū)域中引起廣泛的甲基化變化，這與主要炎癥轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的活性改變有關(guān)。

5 CNV小鼠急性炎癥中重疊的染色質(zhì)可及性，甲基化和表達(dá)數(shù)據(jù)集

由于表達(dá)通常與染色質(zhì)可及性的局部變化相關(guān)，因此進(jìn)行了全基因組ATAC-測序分析，并在CNV中鑒定了469個顯著差異的峰，在DSS/CNV IEC中鑒定了21925個峰。在后者中，有4122個與低甲基化的CNV/DSS特異性LMR重疊（圖3a），這與391個顯著上調(diào)的基因有關(guān)。這些基因豐富了小鼠（圖3b）以及人類結(jié)腸炎和結(jié)腸癌（圖3c）的急性和先天炎癥反應(yīng)，證實了本文對全基因組的甲基化分析。值得注意的是，AP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在這些ATAC-seq峰中高度富集（圖3d）。例如Myd88，它與低甲基化的LMR，DSS獨(dú)特的ATAC-seq峰和DSS治療的CNV小鼠中的活化表達(dá)相關(guān)（圖3e）。Myd88參與細(xì)菌感測，并充當(dāng)Toll樣受體信號通路（包括TLR4）的下游銜接蛋白，已知該蛋白與細(xì)菌脂多糖（LPS）相互作用。因此，結(jié)果證明了宿主腸道上皮基因的微生物群相關(guān)調(diào)控與染色質(zhì)可及性有機(jī)械聯(lián)系。

圖3 腸結(jié)腸炎的ATAC-seq分析

6 急性炎癥獨(dú)立于微生物群

為了發(fā)現(xiàn)在CNV / DSS中觀察到的表觀遺傳變化是否是由于細(xì)菌暴露增加所致，文中用DSS處理了GF小鼠，引起腸道損傷和炎癥（圖4a–c）。RNA-seq數(shù)據(jù)分析僅識別出193個基因，它們顯著改變了GF/DSS與GF樣品中的表達(dá)水平：114個基因被上調(diào)，而79個基因被下調(diào)。這些基因與在經(jīng)DSS處理的CNV小鼠中上調(diào)和下調(diào)的基因部分共享（圖4d），表明了DSS依賴的“核心”作用。相反，在CNV/DSS小鼠中受影響的基因中只有5％在GF/DSS小鼠中受到了影響。這表明在DSS處理中觀察到的顯著表達(dá)變化是由于微生物群引起的。

為了研究在沒有微生物群的情況下與DSS處理相關(guān)的甲基化變化，再次使用WGBS。與未治療的GF小鼠相比，排除與分化相關(guān)的LMRs28之后，鑒定出GF / DSS樣品中有7388個甲基化程度較高的LMR和5628個甲基化程度較低的LMR（圖4e）。WGBS分析的結(jié)果通過有針對性的亞硫酸氫鹽DNA甲基化分析得到證實，并且結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)，在CNV / DSS小鼠中觀察到的變化在GF / DSS小鼠中不存在。隨后將單個LMR分配給特定基因，結(jié)果顯示只有39個LMR在經(jīng)DSS處理的GF小鼠中被甲基化不足，并顯示出顯著的（q≤0.05）表達(dá)增加，以及94個在DSS處理的GF小鼠中被甲基化的LMR，顯示出顯著表達(dá)降低（37個甲基化增加表達(dá)）。這些結(jié)果證實了在沒有微生物群的情況下DSS的相當(dāng)適度的作用。此外，將與改變其在GF / DSS中表達(dá)的LMRs相關(guān)的基因與與改變其在CNVDSS中表達(dá)的LMRs相關(guān)的基因進(jìn)行比較時，僅發(fā)現(xiàn)了44個重疊基因（圖4f）。這些結(jié)果表明，在沒有微生物群的情況下，DSS處理會產(chǎn)生非常小的DNA甲基化依賴性表達(dá)變化。

最后，為了解決出生后DNA甲基化與腸道菌群之間的直接聯(lián)系，進(jìn)行了糞便移植實驗以常規(guī)化GF小鼠，同時將它們保留在無菌隔離器中。重新建立共生菌群可顯著降低在多個分析的LMR處的DNA甲基化（圖4g）。這些發(fā)現(xiàn)證實了在穩(wěn)態(tài)和炎性條件下微生物群在觀察到的表觀遺傳程序設(shè)計作用中的關(guān)鍵作用。

圖4 在腸道菌群缺乏的情況下，炎癥性結(jié)腸的表達(dá)和甲基化變化

7 微生物引起的脫甲基化的分子機(jī)制

為了測試微生物群在結(jié)腸中引起的脫甲基作用是否以相似的方式完成，文中分析了從CNV小鼠中分離出的結(jié)腸隱窩IEC的RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)TET1不表達(dá)，而TET2和TET3（TET2 / 3）表達(dá)。CNV中的TET3（而非TET2）在GF中的表達(dá)明顯高于GF。此外，用抗生素處理CNV小鼠使TET3表達(dá)降低至GF水平，而對小鼠進(jìn)行DSS處理和對結(jié)腸類器官的LPS處理則上調(diào)了TET3表達(dá)水平，這與腸道菌群有關(guān)。

隨后，從Tet2/3fl/fl和KO小鼠的結(jié)腸中分離出隱窩IEC，并進(jìn)行WGBS。結(jié)果表明，在Tet2 / 3 KO樣品中，總體甲基化水平顯著升高（圖5a，圖6d–f），這已通過微生物群誘導(dǎo)的低甲基化LMR中的6個進(jìn)行亞硫酸氫鹽測序而得到進(jìn)一步驗證（圖5a，5b）。這些結(jié)果表明，TET2 / 3在微生物群誘導(dǎo)的去甲基化中起關(guān)鍵作用

對KO小鼠中與高甲基化LMR相關(guān)的六個基因的RT-PCR分析顯示，在所有突變動物中，三個基因的轉(zhuǎn)錄均顯著減少（圖5c），表明在這些調(diào)控序列上TET2 / 3介導(dǎo)的去甲基化起著直接作用在基因誘導(dǎo)中的作用。其他三個基因在突變小鼠中表現(xiàn)出可變表達(dá)，這表明這些LMR不能調(diào)控其相關(guān)基因，或者涉及其他調(diào)控元件。

將Tet2 / 3fl / fl小鼠與在腸道特異性Villin啟動子控制下表達(dá)CRE重組酶的動物雜交，該啟動子可以通過將他莫昔芬施用于動物而被激活（CreER）。對五個DSS誘導(dǎo)的次甲基化LMRs進(jìn)行了針對性的亞硫酸氫鹽測序，結(jié)果表明與Tet2 / 3fl / fl對照小鼠相比，在DSS處理的TET2 / 3 雙KO小鼠中，所有測試的LMR均未經(jīng)歷去甲基化（圖5d）。此外，疾病活動性、體重減輕和組織學(xué)分析證明，Tet2 / 3突變體比Tet2 / 3fl / fl小鼠更易受DSS治療（圖5e–h）。這與微生物群依賴的去甲基化由TET2 / 3介導(dǎo)的觀點(diǎn)相符，并且與WT動物相比，突變小鼠對炎性攻擊的應(yīng)答降低。

圖5 微生物誘導(dǎo)去甲基化的分子機(jī)制

腸道微生物組的多樣性和組成已被研究了十多年，但它們在維持組織穩(wěn)態(tài)和影響宿主表觀遺傳學(xué)方面的確切作用仍知之甚少。已知DNA甲基化在控制腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和分化中起重要作用。文中已經(jīng)研究了腸道菌群對穩(wěn)態(tài)和急性炎癥下IECs的表觀遺傳景觀的影響。雖然先前已經(jīng)證明腸道菌群會影響一小部分基因的DNA甲基化，但在這里展示了菌群如何在全球范圍內(nèi)塑造IEC甲基化組，從而有助于腸道健康和體內(nèi)平衡。研究結(jié)果支持推定的增強(qiáng)子甲基化和微生物群之間的直接聯(lián)系。

在本文的分析中確定的LMR與識別年齡相關(guān)的腸道DNA甲基化變化的成熟相關(guān)差異甲基化區(qū)域（DMR）以及區(qū)分Lgr5陽性干細(xì)胞和分化的分化相關(guān)DMR均不同。在這項研究中鑒定出的LMR顯示出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的高度豐富，例如被稱為“開創(chuàng)性”轉(zhuǎn)錄因子的FoxA家族成員，以及在腸道發(fā)育和體內(nèi)平衡中起主要作用的KLF4和KLF5。最近，有研究表明，KLF4也是一種“開拓性”因子，可在染色質(zhì)打開之前直接與TET2相互作用并將該酶募集到特定的DNA位點(diǎn)。此外，對與甲基化不足的LMR相關(guān)的數(shù)百種共生菌激活基因的途徑分析顯示，與結(jié)腸炎和IBD相關(guān)的基因明顯富集。已知這些基因中的許多基因，例如IFITM3，NOS2和PLA2G2A，都參與保護(hù)腸道免受炎癥反應(yīng)。因此，腸道生理發(fā)育過程中DNA甲基化程序的改變可能會導(dǎo)致“早期前哨”反應(yīng)基因的上調(diào)，這對于正常腸道的動態(tài)平衡很重要。研究的發(fā)現(xiàn)GF小鼠沒有激活這組反應(yīng)基因，這為為什么這種小鼠對DSS誘導(dǎo)的炎癥更敏感提供了進(jìn)一步的解釋。穩(wěn)態(tài)條件下的微生物可能引發(fā)了生命后期發(fā)炎的疾病中基因表達(dá)的變化。在不同細(xì)胞譜系的發(fā)育過程中觀察到了增強(qiáng)子的表觀遺傳啟動。重要的是，這是通過基因甲基化分析而不是基因表達(dá)分析揭示的，從而強(qiáng)調(diào)了DNA甲基化在準(zhǔn)備細(xì)胞應(yīng)對未來挑戰(zhàn)中的作用。

炎癥是一種保護(hù)性反應(yīng)，主要是面對和消除病原體，是生存所必需的。先前結(jié)果已經(jīng)表明，慢性炎癥信號建立了表觀遺傳程序，該程序使結(jié)腸IEC中的一組特定基因沉默，這有助于炎癥誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。該過程代表了人類結(jié)直腸癌的一個顯著特征，可用于正確分類結(jié)直腸癌樣品。在當(dāng)前的研究中，結(jié)果表明，CNV小鼠對急性結(jié)腸炎的表觀遺傳反應(yīng)不同于在慢性炎癥中檢測到的反應(yīng)。在急性炎癥中，與慢性炎癥相比，PMD比在慢性疾病中更為明顯，并且未檢測到甲基化高。

本研究結(jié)果還提供了成千上萬的未表征微生物群調(diào)節(jié)的LMR /推定的增強(qiáng)子圖集，這些圖譜描述了染色質(zhì)的高度可及性。以前曾有人提出，與微生物群相關(guān)的影響與組蛋白修飾的改變相比，與總?cè)旧|(zhì)可及性的改變更多地相關(guān)。本研究結(jié)果表明，IEC基因的微生物群依賴性調(diào)節(jié)與DNA甲基化和染色質(zhì)可及性具有機(jī)械聯(lián)系，如ATAC-seq所確定。這在涉及生理和人類疾病的腸道宿主基因的調(diào)控中提供了另一個重要的層。

本研究發(fā)現(xiàn)暴露于共生菌群會導(dǎo)致調(diào)節(jié)元件上的局部DNA甲基化變化，這是TET2 / 3依賴性的，而且這最終激活了一組“早期哨兵”反應(yīng)基因，以維持腸道的動態(tài)平衡。此外，暴露于右旋糖酐硫酸鈉引起的急性炎癥中的微生物會導(dǎo)致DNA甲基化和染色質(zhì)在調(diào)節(jié)元件上的可及性發(fā)生變化，從而導(dǎo)致基因表達(dá)程序發(fā)生改變，這些基因表達(dá)程序富含結(jié)腸炎和結(jié)腸癌相關(guān)功能。最后，通過采用遺傳干預(yù)，表明微生物群誘導(dǎo)的表觀遺傳程序?qū)τ隗w內(nèi)適當(dāng)?shù)哪c道穩(wěn)態(tài)是必要的。

你可能還喜歡

1. 2019年度回顧 | 微生態(tài)環(huán)境微生物類微文大合輯
   

2. 2019年度回顧 | 微生態(tài)人體/動物微生物類微文大合輯

3. 2019年度回顧 | 技術(shù)貼合輯大放送