三陰乳腺癌（TNBC）是一種侵襲性乳腺癌亞型，具有廣泛的腫瘤間和瘤內(nèi)異質(zhì)性，表現(xiàn)出更多的血管生成和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等臨床特征。對腫瘤和腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞水平的分析，有利于揭示TNBC中腫瘤細(xì)胞多樣性的確切性質(zhì)，以及腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)免疫細(xì)胞群體。

作者利用GEO及TCGA數(shù)據(jù)庫中的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)、bulk RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析方法，揭示了TNBC中腫瘤的異質(zhì)性以及M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(M2 TAMs)與臨床結(jié)果的關(guān)系。

（1）scRNA-seq數(shù)據(jù)：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(GSE118389和GSE75688)從GEO數(shù)據(jù)庫下載；

（2）Bulk RNA-seq及臨床數(shù)據(jù):TCGA數(shù)據(jù)庫中的TNBC數(shù)據(jù)，通過UCSC Xena瀏覽器下載。

作者通過單細(xì)胞RNA-seq鑒定免疫細(xì)胞群體，分析腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，揭示了腫瘤異質(zhì)性以腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞為特征，在腫瘤浸潤性巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)高比例的TAMs。之后，作者進(jìn)行了bulk RNA-seq分析，找出TAMs和生存之間的聯(lián)系，應(yīng)用多種生物信息學(xué)方法對TNBC中TAMs的生物學(xué)特性進(jìn)行分析，建立了與TAM相關(guān)的基因特征，以預(yù)測生存和免疫治療反應(yīng)。

（1）TNBC細(xì)胞中腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性

作者首先通過檢索到的scRNA-seq和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，分別分析了腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的腫瘤間和瘤內(nèi)異質(zhì)性。在腫瘤細(xì)胞中，從單細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)血管生成、細(xì)胞干性和EMT高度相關(guān)，并鑒定出同時高表達(dá)的細(xì)胞亞群。作者推斷在TNBC中發(fā)現(xiàn)的這三個信號之間很強(qiáng)的相關(guān)性可能會導(dǎo)致TNBC中更多的轉(zhuǎn)移表型和更高的復(fù)發(fā)率。

（2）TNBC細(xì)胞中的免疫細(xì)胞異質(zhì)性

作者通過UMAP降維分析，將免疫細(xì)胞分成了三個簇(T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。在TNBC中，T細(xì)胞浸潤表現(xiàn)為瘤間和瘤內(nèi)異質(zhì)性。許多檢查點(diǎn)分子，如TIGIT和LAG3，在一些T細(xì)胞中高表達(dá)，這可能是檢查點(diǎn)阻斷治療的靶點(diǎn)。M2型TAMs在TNBC中明顯上調(diào)。對于腫瘤浸潤的B細(xì)胞，作者分析了B細(xì)胞的功能狀態(tài)，如抗凋亡、幼稚記憶、細(xì)胞因子、促凋亡、增殖、生發(fā)中心和相關(guān)基因表達(dá)特征。B細(xì)胞在TNBC患者之間和同一TNBC患者內(nèi)表現(xiàn)出不同的活性分布。

在TNBC腫瘤組織的巨噬細(xì)胞中，M2型TAMs的典型基因信號如MS4A6A和PLAUR異常表達(dá)。巨噬細(xì)胞中顯著表達(dá)的基因也參與炎癥和血管生成功能。TGFBI、MS4A6A和CD163等M2型基因在TNBC的大多數(shù)巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。此外，已知的促進(jìn)血管生成、EMT和腫瘤進(jìn)展的基因，如IL8和PLAUR，在TNBC巨噬細(xì)胞中過表達(dá)。從與B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)的基因組的GSVA富集分?jǐn)?shù)顯示，M2型巨噬細(xì)胞占TNBC中總巨噬細(xì)胞的比例很高?？傮w而言，M2型TAMs是TNBC中的主要巨噬細(xì)胞類型。

（3）M2型TAM與TNBC患者的低生存率相關(guān)

利用TCGA TNBC患者的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄組圖譜，作者探索了M2型TAM密度與RFS之間的關(guān)系。生存分析及Cox比例風(fēng)險回歸模型顯示，TAMS的高豐度與TNBC患者較差的無復(fù)發(fā)生存期(RFS)相關(guān)。

為進(jìn)一步了解TAMs在TNBC中的潛在作用，作者利用WGCNA分析鑒定TAM相關(guān)的gene signature。作者先篩選出與M2型TAM得分相關(guān)性最高的“TAM模塊”，然后在TAM模塊中找到的hub基因，之后對hub基因進(jìn)行單變量Cox比例風(fēng)險模型和回歸分析篩選出TAM相關(guān)gene signature。

最后，作者根據(jù)來自GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集，利用COX回歸分析和SsGSEA分析驗證了TAM相關(guān)gene signature預(yù)測TNBC患者RFS的能力，并且發(fā)現(xiàn)TAM相關(guān)gene signature與代謝之間存在負(fù)相關(guān)，這暗示了TAM與TNBC代謝變化之間的潛在關(guān)聯(lián)。

（4）TAM相關(guān)gene signature的分子分類

根據(jù)TAM相關(guān)gene signature的表達(dá)模式，將TNBC患者分為不同的亞組。熱圖顯示了兩個簇之間的差異表達(dá)基因。生存分析顯示這兩組患者具有不同的RFS結(jié)果和M2型TAM密度，這進(jìn)一步證實了M2型TAM與TAM相關(guān)gene signature之間的關(guān)聯(lián)。

（5）M2型TAM相關(guān)基因預(yù)測免疫治療反應(yīng)

作者通過兩種常用的機(jī)器學(xué)習(xí)方法--隨機(jī)森林和支持向量機(jī)，尋找gene signature中與TAM密度最相關(guān)的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VIPR1、ABCD4、SLC40A1和SCNN1A等幾個基因是預(yù)后不良的因素，并且這四個基因參與代謝變化，進(jìn)一步說明了TAM與TNBC代謝變化之間的潛在關(guān)聯(lián)。最后，作者將TCGA TNBC數(shù)據(jù)集作為訓(xùn)練集，建立了一個基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的模型，通過TAM相關(guān)gene signature預(yù)測免疫治療的反應(yīng)，并用GEO數(shù)據(jù)集作測試集來評估準(zhǔn)確度。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了M2型TAMs在TNBC治療中對免疫治療效果的重要性。

研究結(jié)論：

（1）確定腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞群體都是TNBC中腫瘤間和瘤內(nèi)異質(zhì)性的來源。

（2）在單細(xì)胞水平上，EMT、血管生成和細(xì)胞干性之間存在高度的相關(guān)性。

（3）在TNBC患者中，M2型TAM與無復(fù)發(fā)生存（RFS）相關(guān)。

（4）作者構(gòu)建了一個M2型的TAM相關(guān)gene signature來預(yù)測TNBC患者的RFS。

（5）通過支持向量機(jī)和隨機(jī)森林算法發(fā)現(xiàn)了幾個與M2類TAM評分高度相關(guān)的基因。

（6）M2型TAM相關(guān)gene signature建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來預(yù)測免疫治療反應(yīng)。

研究局限性：

（1）TAM相關(guān)基因簽名的臨床價值需要在前瞻性設(shè)計的臨床試驗中進(jìn)一步驗證。

（2）應(yīng)該進(jìn)行大型、設(shè)計良好的前瞻性人群研究，以調(diào)查TAM的復(fù)雜作用，并驗證TAM相關(guān)gene signature的結(jié)果。

（3）TNBC中TAMS、EMT、血管生成和細(xì)胞干性之間的潛在串?dāng)_和分子相互作用需要進(jìn)一步的實驗研究。