編譯：小北，編輯：夏甘草、江舜堯。

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免疫檢測(cè)點(diǎn)封閉（ICB）能夠通過腫瘤細(xì)胞破壞免疫監(jiān)視并且改變腫瘤處理。然而ICB僅存在于特種癌癥的少數(shù)病人中，其他的治療策略來加強(qiáng)抗腫瘤的免疫性已經(jīng)提出，包括在腫瘤微環(huán)境（TME）中敲除促癌因子或者免疫抑制細(xì)胞、利用激動(dòng)劑抗體活化特異的免疫細(xì)胞群體。不幸的是，研究者對(duì)TME的復(fù)雜性并未了解全面，使得這些研究大都是在臨床上而不是在已有的機(jī)制假說基礎(chǔ)上。

單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）是剖析實(shí)體瘤復(fù)雜性的有力技術(shù)，其能夠詳細(xì)的描述細(xì)胞的多樣性和異質(zhì)性的表型。在人類原發(fā)性腫瘤中基于轉(zhuǎn)錄組分析的scRNA-seq不僅能夠揭示T細(xì)胞的異質(zhì)性，同樣能通過轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析闡釋T細(xì)胞群體與T細(xì)胞受體之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系。在之前的研究中研究者確定了BHLHE40+ Th1樣細(xì)胞群體在結(jié)腸癌（CRC）腫瘤樣本中顯著富集，同時(shí)伴隨有高的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）。由于僅MSI患者應(yīng)答于ICB，這些發(fā)現(xiàn)提示提高這些T細(xì)胞的功能有望促進(jìn)ICB應(yīng)答。

近期單細(xì)胞方法揭示了腫瘤滲透髓細(xì)胞的復(fù)雜性，包括多種腫瘤類型中與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞（TAMs）和樹突狀細(xì)胞（DCs）。TAMs是一類異質(zhì)性的細(xì)胞，其能產(chǎn)生腫瘤和血管生成生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、免疫抑制等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。靶向抑制TAM生物活動(dòng)的免疫療法已經(jīng)應(yīng)用于臨床，包括通過封閉CSF1R和其配體CSF1和IL-34相互作用破壞巨噬細(xì)胞的擴(kuò)增與分化，最小的單一抗腫瘤的療效已經(jīng)觀察到。

腫瘤相關(guān)的DCs構(gòu)成了腫瘤中髓性細(xì)胞的一小部分，但是在抗腫瘤的T細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。經(jīng)典的DCs(cDCs)基于不同的表型標(biāo)記物或者功能被分為兩個(gè)亞群(cDC1和cDC2)。然而cDC2s在腫瘤中的作用尚不明確，cDC1s能夠?qū)⒛[瘤相關(guān)的抗原傳遞至CD8+T細(xì)胞，在抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。提高DCs功能的多個(gè)策略已經(jīng)應(yīng)用到臨床，活化CD40的方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。然而與CSF1R抑制劑相同，CD40激動(dòng)劑單一的療效有限。研究者致力于開發(fā)這些靶向髓性細(xì)胞的療法依賴于對(duì)實(shí)體瘤中髓性細(xì)胞異質(zhì)性的全面了解，以及在TME中免疫細(xì)胞的功能和相互交流對(duì)治療的影響。

通過結(jié)合基于平板和液滴的scRNA-seq確定人類CRC中腫瘤細(xì)胞類型

研究者首先通過FACS從腫瘤細(xì)胞中分選出CD45+和CD45-細(xì)胞（表1）。經(jīng)過基于液滴的基因組平臺(tái)或者基于平板的全長(zhǎng)Smart-seq2平臺(tái)進(jìn)行scRNA-seq獲取單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組（圖S1A）。將獲取的數(shù)據(jù)與之前同類型病人樣本中T細(xì)胞的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組結(jié)合（圖S1A）。經(jīng)過質(zhì)控和過濾共獲得43,817 (10×scRNA-seq)和10,468 (Smart-seq2)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組(STAR)。如期望的一樣，Smart-seq2平臺(tái)可捕獲更多的基因，包括細(xì)胞因子，CD分子、配體/受體以及轉(zhuǎn)錄因子，與10×scRNA-seq 平臺(tái)相比表現(xiàn)出較弱的分批效應(yīng)（圖S1B–S1F）。

為了確定腫瘤滲透淋巴細(xì)胞的主要群體和亞群結(jié)構(gòu)，研究者在這兩個(gè)數(shù)據(jù)組中分別做了聚類分析，確定了主要的免疫細(xì)胞類型，包括髓性細(xì)胞、先天性淋巴樣細(xì)胞(ILCs)、T細(xì)胞和B細(xì)胞（圖S2A）。進(jìn)一步的無監(jiān)督聚類分別從10×scRNA-seq和Smart-seq2兩個(gè)組別中獲取38和36個(gè)淋巴細(xì)胞集簇（圖1A）。研究者利用推理回歸模型確定了兩個(gè)組別中集簇的相似性和關(guān)聯(lián)（圖S2E）。淋巴細(xì)胞集簇表現(xiàn)高度相似性的定義為同一細(xì)胞集簇，殘留的依據(jù)它們特異的基因特征進(jìn)行人為注釋。兩個(gè)平臺(tái)間的淋巴細(xì)胞。腫瘤相關(guān)的胞漿B細(xì)胞、腸相關(guān)的淋巴組織B細(xì)胞、囊泡B細(xì)胞和生發(fā)中心B細(xì)胞高度相似，并且可以依據(jù)不同的免疫球蛋白重鏈特征進(jìn)行區(qū)別（圖S2F）。同樣，兩個(gè)平臺(tái)都能捕獲ILCs，包括血液和組織中富集的NK細(xì)胞、在正常粘膜中富集的ILC3細(xì)胞（圖S2B和S2C）以及腫瘤富集的組織上的NK細(xì)胞(hI03)，hI03對(duì)抑制型受體、細(xì)胞毒性分子以及細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)與CD8+疲勞的T細(xì)胞相似（圖S2G）。與淋巴細(xì)胞不同，髓性細(xì)胞在這兩個(gè)平臺(tái)中表現(xiàn)出更大的分歧。特別是，兩個(gè)中間物狀態(tài)單核細(xì)胞亞群（hM07和hM11）主要被10×平臺(tái)捕獲（圖1B），這也提示每個(gè)病人中測(cè)序的大量細(xì)胞需要確定稀少的或者轉(zhuǎn)變中的細(xì)胞群體。最終，研究者從這兩個(gè)平臺(tái)中捕獲了13個(gè)髓性細(xì)胞集簇、4個(gè)ILC集簇、18個(gè)T細(xì)胞集簇以及5個(gè)B細(xì)胞集簇，這一結(jié)果與不同癌癥scRNA-seq的結(jié)果大部分吻合。所有的細(xì)胞集簇通過t-SNE分析可視化（圖1C、S3A）。每個(gè)集簇由多個(gè)不同病人中的細(xì)胞組成并且與不同組織分布圖譜相關(guān)（圖S3B、S3C）。

對(duì)于Smart-seq2平臺(tái)捕獲的非免疫細(xì)胞，聚類分析發(fā)現(xiàn)有12個(gè)細(xì)胞集簇（圖S3D）。由拷貝數(shù)變異定義的腫瘤細(xì)胞在基因表達(dá)上具有更高的異質(zhì)性，因此形成了病人特異的集簇（圖S3E、S3F）。與之前在CRC中的報(bào)道一致，研究者在正常粘膜和腫瘤中確定了幾個(gè)非癌細(xì)胞集簇，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、四組上皮細(xì)胞（腸上皮細(xì)胞、干細(xì)胞樣細(xì)胞以及兩組杯狀細(xì)胞）、兩組成纖維細(xì)胞。重要的是與正常粘膜相比，成肌纖維細(xì)胞和癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞（CAFs）更易在CRC腫瘤中發(fā)現(xiàn)（圖S3G、S3H）。

綜上，Smart-seq2平臺(tái)能夠捕獲更多的基因、對(duì)調(diào)節(jié)的信號(hào)通路能夠允許有一個(gè)更大的測(cè)序深度（圖S1），10×測(cè)序平臺(tái)能夠有效的獲得更多的集簇（圖1B）。Smart-seq2的基因深度與10×scRNA-seq的細(xì)胞覆蓋能夠使細(xì)胞類型或者稀少群體最大化，并且提高細(xì)胞集簇的結(jié)果。因此，研究者權(quán)衡兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)來定義腫瘤滲透髓性細(xì)胞的特定及其在CRC中與其他細(xì)胞之間的相互作用。

單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞亞群具有組織特異性

研究者首先從13個(gè)髓性細(xì)胞亞群中剖析了基因特征（圖2A-2C、S4A-S4B、表S2）。在這些集簇中，肥大細(xì)胞（hM01）能夠表達(dá)一組特異的基因，例如TPSAB1/2、CPA3、MS4A2、KIT（圖2B），與肺癌相反，在腫瘤和正常的粘膜中相對(duì)富集（圖2C），這與在CRC中腸道細(xì)菌的內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及炎癥調(diào)節(jié)一致。

三個(gè)DC集簇(hM02-hM04)、漿細(xì)胞樣的DC (pDC)、cDC2以及cDC1細(xì)胞，其特征是HLA-DRs的高表達(dá)和CD14的低表達(dá)（圖S4B、S4C），并進(jìn)一步的由LILRA4/LILRB4、CD1C/FCER1A、XCR1/BATF3的特異性表達(dá)區(qū)分（圖2B）。這些DCs在CRC腫瘤和正常的粘膜中富集（圖2C）。三個(gè)血液中富集的集簇(hM05-hM07)，其典型特征是經(jīng)典的CD14^hiCD16、非經(jīng)典的CD14+CD16^hi以及一個(gè)中間體CD14^hiCD16+單核細(xì)胞（圖S4A、S4B），與之前的報(bào)道大致一致。

剩余的集簇依據(jù)CD68、CD163、MRC1的表達(dá)被確認(rèn)為巨噬細(xì)胞。在正常粘膜與病毒比較中組織上的巨噬細(xì)胞（RTMs）證實(shí)hM08相對(duì)富集，hM09和hM10更易富集，而組織上富集的集簇由TAMs(hM12-hM13)注釋（圖2C）。促炎癥細(xì)胞活素基因IL1B在所有RTM群體中均表達(dá)，而NLRP3+ RTMs表達(dá)最高（圖2D），這與NLRP3在炎癥組中激活IL-1b并且調(diào)節(jié)腸穩(wěn)態(tài)扮演的角色是一致的。NLRP3+和PLTP+的RTMs與IL1B+ RTMs相比都表達(dá)較低水平的HLA-DR，而PLTP+ RTMs特異的表達(dá)LYVE1、IL10（圖2D），這與近期的報(bào)道Lyve1^hiMHCII^lo單核細(xì)胞衍生的RTMs大部分坐落在血管上，具有限制炎癥和纖維化的作用。

TAMs主要由腫瘤滲透單核細(xì)胞樣前體發(fā)育而來

近期在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)TAMs能夠從RTMs以及新募集的單核細(xì)胞逐步分化成巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生。利用嵌在擴(kuò)散圖譜上的RNA速度分析預(yù)測(cè)細(xì)胞的命運(yùn)，發(fā)現(xiàn)從CD14表達(dá)的單核細(xì)胞到FCN1+樣單核細(xì)胞具有強(qiáng)烈的方向流以及不同的巨噬細(xì)胞群體（圖2E）。顯著的是，腫瘤富集的FCN1+單核樣細(xì)胞與血液CD14+單核細(xì)胞高度相似，更表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移進(jìn)入腫瘤并且具有腫瘤特異轉(zhuǎn)錄程序的單核細(xì)胞亞群（圖S4D）。

兩個(gè)正交算法URD和PAGA進(jìn)一步解釋了巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄軌跡，提示FCN1+單核樣細(xì)胞能夠通過不同的RTMs引起C1QC+ 和SPP1+ TAM亞群（圖2F、S4E）。有趣的是，C1QC+ TAMs能夠與IL1B+ RTMs相連，并且兩個(gè)集簇能夠表達(dá)C1Q補(bǔ)充成分以及HLA-DR。重要的是，與C1QC+ TAMs 相比，IL1B+ RTMs表達(dá)低水平的APOE和APOC1（圖2D），這也提示這些細(xì)胞與C1QC+ TAMs的功能表型部分相似，但是與腫瘤應(yīng)答相似的轉(zhuǎn)錄程序并未上調(diào)。相反，SPP1+ TAMs主要與NLRP3+ RTMs相關(guān)，兩個(gè)集簇都表達(dá)低水平的HLA-DRs。的確，NLRP3+RTMs部分仍然在腫瘤內(nèi)出現(xiàn)（圖2C），這也提示在TME中與SPP1+ TAMs 相反。綜上，C1QC+和SPP1+ TAMs都是從腫瘤滲透單核樣細(xì)胞前體中發(fā)育而來，SPP1+ TAMs 可能由NLRP3+ RTMs衍生而來（圖S4F）。另外，體外正?；蛘呷毖鯒l件下進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞因子或者生長(zhǎng)因子存在下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD14+單核細(xì)胞在TAM群體差異表達(dá)（圖S3A），IL-1b和VEGF家族成員能夠在缺氧條件下上調(diào)SPP1+ TAMs標(biāo)記物MARCO的表達(dá)（圖S4G），這與研究者的假說是一致的：TME能夠促進(jìn)TAM群體的發(fā)育。然而，在腫瘤和正常組織中全面揭示復(fù)雜的巨噬細(xì)胞的發(fā)育軌跡需要體外細(xì)胞分化和體內(nèi)線性軌跡的額外研究。

人類CRC中TAMs的二分功能表型

與乳腺癌和肺癌中的TAMs在TME中表現(xiàn)連續(xù)范圍的表型相反，在CRC中的TAMs具有顯著的二分（圖2F）這也提示在細(xì)胞內(nèi)存在分化的信號(hào)通路。重要的是，在兩者的TAMs中表達(dá)不同的轉(zhuǎn)錄因子，包括C1QC+ TAMs中的MAF/MAFB 和FOS/JUN、在SPP1+ TAMs中的CEBPB和ZEB2 (圖S4H)，這與TAMs兩個(gè)亞群受轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定調(diào)控的發(fā)育和功能一致。在TAMs中與“經(jīng)典活化（M1）”和“選擇性活化（M2）”相關(guān)的基因表達(dá)分析并不能解釋CRC中確定的C1QC+ TAM和SPP1+ TAM的二分（圖S4I）。

研究者進(jìn)一步比較了TAM群體中差異表達(dá)的基因發(fā)現(xiàn)C1QC+ TAMs能夠高表達(dá)補(bǔ)充C1Q的基因TREM2、MERTK、CD80（圖3A），而SPP1+ TAMs能夠特異性的表達(dá)SPP1、MARCO、VEGFA（圖3A）。在兩個(gè)TAM群體中利用GSVA評(píng)估了已知的信號(hào)通路表達(dá)發(fā)現(xiàn)SPP1+ TAMs在腫瘤血管生成、ECM受體相互作用以及腫瘤脈管系統(tǒng)信號(hào)通路富集，而C1QC+ TAMs在補(bǔ)體激活、抗原的加工呈遞信號(hào)通路富集（圖3B）。顯著的是，SPP1+ TAMs還表現(xiàn)出在結(jié)直腸腺瘤和轉(zhuǎn)移的肝癌中特異性富集（圖3B、3C），這也提示在CRC中促腫瘤生成和促轉(zhuǎn)移的作用。多色成像的數(shù)據(jù)分別通過共表達(dá)CD68、CD80、MAF或者CD68、MARCO、VEGFA也證實(shí)了TAMs兩個(gè)亞群的存在（圖3D）。此外只有C1QC+ TAMs在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和正常個(gè)體中結(jié)腸粘膜中被確認(rèn)，而在SPP1+ TAMs在非癌組織中大量缺失（圖S4J、S4K），這提示在CRC的TME中二分的功能表型。

TAM和cDC亞群構(gòu)成了細(xì)胞與細(xì)胞相互作用的中心

為了分析CRC整體的細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用，研究者通過結(jié)合scRNA-seq和TCGA中bulkRNA-seq的數(shù)據(jù)進(jìn)行了計(jì)算模型分析，除了確定了與特定集簇高度相關(guān)的基因，研究者也將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中高度相關(guān)的基因與scRNA-seq集簇進(jìn)行比對(duì)，確定了共同發(fā)生的特異細(xì)胞類型（圖S5B）。通過利用計(jì)算機(jī)模型到所有在腫瘤中富集的細(xì)胞亞群，研究者建立了CRC中細(xì)胞與細(xì)胞相互作用網(wǎng)格。利用GTEx中正常組織的數(shù)據(jù)庫(kù)研究者進(jìn)行了同樣的分析（圖S5C）。這些分析確定了腫瘤中成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間已知的相互作用，以及正常粘膜中囊泡B細(xì)胞和Tfh細(xì)胞之間的相互作用（圖3E、S5C），提示在未明確描述的細(xì)胞類型的生物學(xué)意義。

在鄰近正常粘膜中確定了B細(xì)胞、T細(xì)胞以及DCs之間的相互作用，更易反映出結(jié)腸淋巴濾泡之間的交流（圖S5C）。相反，在腫瘤細(xì)胞中確定了不同的相互作用，TAMs和cDCs作為相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心，供給與其他細(xì)胞類型中的相互作用（圖3E）。SPP1+ TAMs表現(xiàn)出與CAFs和成肌纖維細(xì)胞之間的相互作用，C1QC+ TAMs和兩組cDCs主要與其他的免疫細(xì)胞特別是T細(xì)胞亞群相互作用（圖3E），提示其在調(diào)節(jié)抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答中的功能。

為了進(jìn)一步揭示調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞相互作用的分子網(wǎng)絡(luò)，研究者計(jì)算了scRNA-seq數(shù)據(jù)中配體-受體對(duì)的吸引力并且模擬分析確定了展示顯著的細(xì)胞群體特異性的數(shù)以百計(jì)的相互作用對(duì)。關(guān)于髓性細(xì)胞和T細(xì)胞的配體-受體對(duì)中，CXCL10-CXCR3在C1QC+ TAMs中顯著富集，強(qiáng)調(diào)了C1QC+ TAMs在招募活化T細(xì)胞中的關(guān)鍵作用。與C1QC+ TAMs和其他淋巴細(xì)胞相比，SPP1+ TAMs更傾向于表達(dá)SDC2，其與CAFs和內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)的MMP2結(jié)合，在多個(gè)腫瘤中與細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。在SPP1+ TAMs和包括SPP1-ITGAV和FN1-ITGA5的其他細(xì)胞亞群相互作用的配體-受體對(duì)，與SPP1+ TAMs相互作用的表達(dá)高水平的SPP1和FN1（圖3F、S5D、S5F）。研究者的分析提示SPP1和FN1可能與某些整聯(lián)蛋白相互作用促進(jìn)CRC腫瘤的發(fā)生發(fā)展?？傊?，scRNA-seq的數(shù)據(jù)提示TAMs和cDCs包含細(xì)胞與細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心，TAMs可能通過與CRC的TME中不同的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞相互作用發(fā)揮二分的功能。

人類和小鼠中共有的主要腫瘤相關(guān)的髓性細(xì)胞群體

接下來，研究者通過scRNA-seq研究了小鼠腫瘤模型中不同髓性細(xì)胞群體對(duì)抗腫瘤免疫應(yīng)答的效果，并且將這些數(shù)據(jù)與人類髓性細(xì)胞異質(zhì)性的發(fā)現(xiàn)相聯(lián)系。研究者關(guān)注了已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床的治療策略：通過CSF1R封閉導(dǎo)致的TAM敲除以及通過CD40激動(dòng)劑導(dǎo)致的DC活化。研究者首先在多重同源的小鼠腫瘤模型中評(píng)估了治療效果，確定了Renca腫瘤的生長(zhǎng)對(duì)抗CSF1R封閉的抗體敏感，以及MC38的生長(zhǎng)對(duì)抗CD40的抗體敏感（圖S6A）?；谶@些研究，利用10×基因測(cè)序平臺(tái)對(duì)從Renca或者MC38腫瘤中分離得到的免疫細(xì)胞進(jìn)行多樣的scRNA-seq研究。

利用基于圖表的集簇分析在Renca和MC38的scRNA-seq數(shù)據(jù)組中確定了主要的免疫細(xì)胞亞群，包括T細(xì)胞和髓性細(xì)胞群體（圖S6D）。為了更好比較腫瘤相關(guān)小鼠髓性細(xì)胞亞群與人類中的亞群，研究者將取自兩個(gè)模型中的髓性細(xì)胞進(jìn)行綜合聚類，確定了15個(gè)分立的細(xì)胞集簇（圖3G）。每個(gè)集簇都與表示不同細(xì)胞類型的特異基因表達(dá)譜相關(guān)（圖S6E），并且每個(gè)集簇大都在MC38和Renca腫瘤中確定（確定S6F）。為了確定人類和小鼠群體中的關(guān)系，研究者進(jìn)行了系統(tǒng)的相似性分析，確定了在種系中多樣相應(yīng)的髓性細(xì)胞群體（圖3H）。

首先看cDC群體，研究者確定了小鼠中兩個(gè)cDC1亞群(mM06和mM07)（圖S6G），兩者都能夠與人類CRC中單個(gè)cDC1集簇(hM04)對(duì)應(yīng)（圖3H）。研究者通過再聚類對(duì)人類BATF3+ cDC1集簇的異質(zhì)性進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)人類中cDC1細(xì)胞的表型（圖S6H）。重要的是，這兩組cDC1表型與已知cDC1細(xì)胞的未成熟活化狀態(tài)以及最近描述的人類和小鼠腫瘤中活化的LAMP3+CCR7+ DCs相似（圖S6I）。研究者在小鼠腫瘤中確定了兩個(gè)cDC2集簇(mM04和mM05)能夠與人類CRC(hM03)中單個(gè)cDC2群體對(duì)應(yīng)（圖3H）。重要的是，Itgax+ cDC2集簇像代表經(jīng)典的cDC2亞群，而Cd209a+ cDC2集簇與單核細(xì)胞衍生的DCs、可能區(qū)別于新滲透的血液中的單核細(xì)胞具有相同的特征。

與DC群體相反，TAMs在人類和小鼠間表現(xiàn)出更大程度的表型異質(zhì)性，與肺癌中近期的發(fā)現(xiàn)相同。然而，小鼠巨噬細(xì)胞亞群(mM11-mM14)與人類C1QC+ TAMs高度相似并且與人類SPP1+ TAMs的基因表達(dá)極少重疊。相反小鼠巨噬細(xì)胞集簇mM15_Macro-Vegfa與人類SPP1+ TAMs高度相似（圖3H）。利用人類TAM集簇分析的方法對(duì)小鼠TAM亞群進(jìn)行了相似的信號(hào)通路分析（圖3B），研究者發(fā)現(xiàn)小鼠TAM群體以血管生成、缺氧以及T細(xì)胞相互作用基因特征為基礎(chǔ)也是分開的（圖4A）。這些數(shù)據(jù)提示在人類CRC病人和小鼠腫瘤模型中存在功能類似的TAM群體。

促進(jìn)血管生成的巨噬細(xì)胞群體耐受于對(duì)抗CSF1R封閉的治療

研究者接下來評(píng)估了抗CSF1R對(duì)小鼠TAM群體的效果并且將這些發(fā)現(xiàn)與人類中對(duì)應(yīng)的群體相關(guān)聯(lián)。如所期盼的，Renca腫瘤小鼠經(jīng)anti-CSF1R處理后TAMs的頻率降低（圖4B）。然而，檢測(cè)到的TAMs群體仍然anti-CSF1R處理。對(duì)這個(gè)anti-CSF1R耐受的群體評(píng)估發(fā)現(xiàn)高表達(dá)F4/80的巨噬細(xì)胞顯著降低（圖S7A-S7D），提示anti-CSF1R處理的不同巨噬細(xì)胞群體敏感性差異。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，Renca腫瘤的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)集簇mM12和mM14完全缺失，但是在anti-CSF1R處理后TAM集簇中的mM11、mM13、mM15少量降低（圖4C、4D）。的確，某個(gè)集簇的頻率在anti-CSF1R處理組中升高（圖4D），似乎是由于免疫細(xì)胞中巨噬細(xì)胞的降低。研究者進(jìn)一步檢測(cè)了TAM群體在anti- CSF1R處理后的敏感性差異如何改變TME。研究者發(fā)現(xiàn)anti-CSF1R-耐受的TAMs表達(dá)的基因參與血管生成例如Vegfa、免疫抑制例如Cd274和Arg1（圖4E）。重要的是，經(jīng)anti-CSF1R處理后腫瘤細(xì)胞中殘留的巨噬細(xì)胞也更易與腫瘤血管相關(guān)（圖4F），這也提示其在調(diào)節(jié)血管生成過程中扮演的角色。

鑒于CSF1R信號(hào)在控制巨噬細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的作用，研究者進(jìn)一步評(píng)估了是否TAM增殖與anti-CSF1R處理敏感性是否相關(guān)。Anti-CSF1R-敏感的群體(mM12, mM14)提高了Mki67的表達(dá)并且增殖數(shù)高于耐受的群體(mM11、mM13、mM15)（圖4E、4G）。重要的是，在人類腫瘤中C1QC+ TAMs的增殖數(shù)也高于SPP1+ TAMs（圖4H）。這些結(jié)果提示在小鼠中，CSF1R封閉也導(dǎo)致細(xì)胞周期中巨噬細(xì)胞缺失，導(dǎo)致在TAM亞群中這種處理的差異效果。將這些結(jié)果推斷至人類，CSF1R封閉可能更易使C1QC+ TAM亞群中的一部分缺失，而保留SPP1+ TAMs。為了進(jìn)一步將小鼠中的發(fā)現(xiàn)與人類CRC聯(lián)系，研究者比較了不同水平C1QC+ TAM和SPP1+ TAM基因特征個(gè)體的存活，發(fā)現(xiàn)在CRC病人中低水平的C1QC+ TAM和高水平的SPP1+ TAM與較差的預(yù)后相關(guān)（圖4I）。這些發(fā)現(xiàn)提示anti-CSF1R處理可能對(duì)促腫瘤生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞群體缺失并不充分，該特性可能使Renca小鼠腫瘤模型和人類癌癥病人中anti-CSF1R的單一效果甚微。

Anti-CD40處理cDC1群體導(dǎo)致早期特異性擴(kuò)增

研究者進(jìn)一步聚焦于揭示anti-CD40激動(dòng)劑治療的機(jī)制。MC38腫瘤小鼠進(jìn)行anti-CD40處理導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)降低（圖S6A），當(dāng)與PD1封閉結(jié)合時(shí)效果提高（圖5A、5B）。從人類CRC和小鼠MC38腫瘤樣本中的scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)CD40在多個(gè)DC和巨噬細(xì)胞亞群中表達(dá)，特別是cDC1集簇（圖5C、5D）。與這些發(fā)現(xiàn)一致，研究者進(jìn)行的細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)cDCs與多樣的T細(xì)胞亞群存在廣泛的相互作用（圖3E、5E），并且發(fā)現(xiàn)CD40LG在人類和小鼠腫瘤中多樣的CD4+ T細(xì)胞集簇中高表達(dá)（圖5C、5D）。盡管CD40/CD40LG信號(hào)通路調(diào)節(jié)髓性細(xì)胞與T細(xì)胞之間的相互作用，研究者進(jìn)一步確定了更易受CD40激動(dòng)劑影響的特異的髓性細(xì)胞和T細(xì)胞。

不同時(shí)間點(diǎn)anti-CD40激動(dòng)劑處理的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)anti-CD40激動(dòng)劑調(diào)節(jié)能夠提高Ccl22+ cDC1細(xì)胞的頻率，而其他的DC亞群在處理2天后或者降低或者未改變（圖5F）。Anti-CD40抗體能夠顯著活化這些cDC1細(xì)胞，由CD80和CD86的表達(dá)衡量（圖5G、5H）。此外，anti-CD40能夠提高cDC1細(xì)胞產(chǎn)生IL-12（圖5I），該細(xì)胞因子能夠提高Th1發(fā)育以及CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生IFNg。由于anti-CD40抗體對(duì)TAMs的效果并不深遠(yuǎn)（圖S7E），研究者在2天后觀察到了Mafb+ TAMs的瞬時(shí)降低，并且在10天后顯著降低（圖S7E），這可能反應(yīng)了CD40激動(dòng)劑處理導(dǎo)致腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞頻率的大范圍改變。研究者經(jīng)過scRNA-seq分析確定了Ccl22+ cDC1細(xì)胞作為主要的髓性細(xì)胞，在MC38模型中anti-CD40處理后激活。重要的是，活化的cDC1s的顯著基因與CRC患者的整體存活相關(guān)（圖5J），這也提示，anti-CD40能夠激活這些細(xì)胞與腫瘤相關(guān)。

Anti-CD40處理能夠提高效應(yīng)器記憶CD8+T細(xì)胞并且引起腫瘤中Bhlhe40+ Th1樣細(xì)胞的活化和擴(kuò)增

研究者進(jìn)一步探究了anti-CD40處理對(duì)腫瘤滲透T細(xì)胞的功能影響。從MC38腫瘤模型中分離得到的T細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq（圖S7F、S7G），結(jié)果顯示某些CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群受CD40激動(dòng)劑處理的影響（圖6A）。研究者進(jìn)一步從scRNA-seq中捕獲了TCR a-和b-鏈的序列（表S6A），利用之前開發(fā)的STARTRAC索引定義T細(xì)胞的克隆增殖、轉(zhuǎn)移和發(fā)育。Anti-CD40處理能夠顯著提高腫瘤記憶CD8+T細(xì)胞亞群的比例，但是降低疲勞的CD8+T細(xì)胞亞群的頻率特別是在10天處理后（圖6B）。此外，anti-CD40處理能夠顯著改變表達(dá)圖譜以及Lag3+ Tex和Mki67+ Tex亞群中疲勞標(biāo)記物的動(dòng)力學(xué)，伴隨處理后Ctla4和Tigit的表達(dá)顯著降低且10天后Pdcd1和Lag3的表達(dá)顯著降低（圖6C）。流式實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)了scRNA-seq的結(jié)果，說明anti-CD40處理能夠挺高效應(yīng)CD8+T細(xì)胞，降低PD1+疲勞的CD8+T細(xì)胞（圖6D-6G）。利用STARTRAC分析，研究者發(fā)現(xiàn)Ccl5+ Tem CD8+T細(xì)胞與其他CD8+T細(xì)胞相比具有較高的遷移指數(shù)（圖S7H），這與之前的發(fā)現(xiàn)CD8+ Tem細(xì)胞比Trm或者疲勞的CD8+ T細(xì)胞更易遷移。的確，anti-CD40處理能夠戲劇性的提高Ccl5+ Tem CD8+ T細(xì)胞的比例，而不是tdLNs中Cxcr6+ Trm群體（圖S7I）。在Ccl5+ Tem亞群中進(jìn)一步分離了TCR克隆表型發(fā)現(xiàn)，在anti-CD40處理后具有更高克隆擴(kuò)增的細(xì)胞在腫瘤和tdLN中表現(xiàn)出更多的TCR(圖6H、6I、S7J、表S6B)。此外，Ccl5+ Tem和Cxcr6+ Trm CD8+ T細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)顯著高于其他CD8+T細(xì)胞亞群對(duì)，提示腫瘤中某些Cxcr6+ Trm細(xì)胞可能從滲透的Ccl5+ Tem細(xì)胞中衍生而來，這一過程經(jīng)anti-CD40處理后加強(qiáng)（圖6J）。綜上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)揭示了anti-CD40處理對(duì)擴(kuò)增、轉(zhuǎn)移、腫瘤滲透Tem和TrmCD8+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)換效果。

研究者同樣發(fā)現(xiàn)CD40激動(dòng)劑處理對(duì)腫瘤滲透CD4+T細(xì)胞亞群產(chǎn)生影響。盡管anti-CD40處理2天后能夠顯著擴(kuò)增Treg細(xì)胞，Treg細(xì)胞在10天處理后降低（圖7A）。STARTRAC-擴(kuò)增系數(shù)證實(shí)anti-CD40處理2天后能夠提高Treg的擴(kuò)增，在10天后受到限制（圖7B）。相反，anti-CD40處理2天和10天后能夠特異性提高Bhlhe40+ Th1-樣細(xì)胞的比例，這也證實(shí)anti-CD40能夠激發(fā)這些細(xì)胞的克隆增殖（圖7B）。有趣的是，研究者注意到anti-CD40處理能夠顯著降低Bhlhe40+ Th1-樣細(xì)胞中Cd40lg的表達(dá)（圖7C、7D），實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步由流式證實(shí)（圖7E）。這些結(jié)果提示CD40激動(dòng)劑可能提高腫瘤相關(guān)BHLHE40+ Th1-樣細(xì)胞和cDC1細(xì)胞的交流。

之前的研究確定IFNG表達(dá)的BHLHE40+ Th1-樣細(xì)胞在MSI CRC病人群體中富集，對(duì)ICB治療應(yīng)答。研究者確定從MC38分離得到的Bhlhe40+ CD4+ T細(xì)胞也能表達(dá)高水平的Bhlhe40（圖S7K）且產(chǎn)生更多的IFNg(圖7F、7G), 表達(dá)Ki67增殖的標(biāo)記物，進(jìn)一步誘導(dǎo)增殖（圖7H）。因此腫瘤cDC1細(xì)胞中anti-CD40的活化能夠?qū)е?/span>IFNg產(chǎn)生的腫瘤滲透CD4+Th細(xì)胞頻率升高。與這一假說抑制的是，體外研究發(fā)現(xiàn)anti-CD40處理能夠提高DC細(xì)胞的成熟，在CD4+T細(xì)胞中用亞適濃度的抗原處理細(xì)胞進(jìn)一步提高Bhlhe40的表達(dá)而非Tbx21。在人類CRC病人中表達(dá)IFNG的BHLHE40+ Th1-樣細(xì)胞和cDC細(xì)胞進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Th1樣細(xì)胞的基因特征與成熟的和非成熟的cDC1細(xì)胞正相關(guān)。這些cDC1細(xì)胞也在MSI-H CRC病人中顯著富集（圖7J），提示在cDC1細(xì)胞和BHLHE40+ Th1-樣細(xì)胞中存在相互作用。重要的是，研究發(fā)現(xiàn)anti-CD40能夠提高Bhlhe40+ Th1-樣細(xì)胞可能是CD40激動(dòng)劑能夠協(xié)同anti-PD1有效治療的機(jī)制（圖5A、5B）。

研究者揭示了髓性T細(xì)胞和髓性基質(zhì)細(xì)胞在CRC中的相互作用，為免疫治療提供了分子基礎(chǔ)，并通過單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)為分離腫瘤相關(guān)免疫群體發(fā)揮的作用，研究的數(shù)據(jù)組為今后腫瘤滲透免疫細(xì)胞的進(jìn)一步挖掘提供資源。

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