一、 研究背景

許多體細(xì)胞突變已被證實(shí)可以預(yù)測肺腺癌(LUAD)的免疫檢查點(diǎn)封鎖(ICB)治療療效，但因不同研究的測試平臺(tái)，臨界值定義等存在差異，所以需要開發(fā)更有效的臨床預(yù)測工具來確定最有可能從ICB治療中獲得療效的患者。近年來，深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(DNNs)作為一種實(shí)現(xiàn)人工智能的新技術(shù)受到人們的關(guān)注，不僅可用于智能圖像識(shí)別任務(wù)，還可以從基因表達(dá)譜中提取特征，獲得與預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物。

二、 分析流程

三、 結(jié)果解讀

1.基于體細(xì)胞突變的DNN可以預(yù)測免疫療法的臨床效益

作者在TensorFlow(基于Python的機(jī)器學(xué)習(xí)框架)中使用了DNNs對(duì)訓(xùn)練集（MSKCC，n = 143）和兩個(gè)驗(yàn)證集（MSKCC，n = 36和VAN ALLEN隊(duì)列，n = 47）的測序數(shù)據(jù)分析了體細(xì)胞突變。DNN由一個(gè)輸入層、兩個(gè)隱藏層、一個(gè)丟失層和一個(gè)輸出層，激活函數(shù)RELU，損失函數(shù)cross-entropy組成，learning rate和迭代次數(shù)分別設(shè)置為0.0001和3000。輸入層由100個(gè)體細(xì)胞突變組成，輸出層對(duì)應(yīng)治療效果（DCB和NDB）。DCB定義為完全緩解（CR），部分緩解（PR）或持續(xù)≥6個(gè)月的穩(wěn)定疾?。⊿D）;NDB定義為持續(xù)<6個(gè)月或進(jìn)行性疾?。≒D）。下表為本篇研究所用到的五個(gè)隊(duì)列，五個(gè)隊(duì)列數(shù)據(jù)均在cbioportal數(shù)據(jù)庫中獲得。

圖2.ab顯示隨著迭代次數(shù)增加，準(zhǔn)確率逐漸增加和損失值逐漸減小。最后作者確定了23個(gè)體細(xì)胞突變作為DNN的輸入層，兩個(gè)不同的亞組C1（分別為n = 55、19和15）和C2（分別為n = 88、17和32）與治療效果（DCB和NDB）顯著相關(guān)。在DNNs模型中，C1和C2組的23個(gè)體細(xì)胞突變中TP53，KMT2D，EGFR和STK11突變顯著。

接下來的ROC分析進(jìn)一步評(píng)估了不同變量的預(yù)測效果，包括TP53，KRAS，STK11和EGFR突變，TMB和C1與C2。其中，C1和C2的預(yù)測效果最好，AUC=0.884，Youden指數(shù)為0.769(表示診斷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)真正的患病和非患病者的總能力)，證實(shí)了DNNs在預(yù)測免疫反應(yīng)的能力上顯著超過單基因突變和TMB，并在MSKCC隊(duì)列中得到了驗(yàn)證，VAN ALLEN可能因?yàn)闃颖咎?，效果無顯著差異（圖2.c）。作者接下來還使用了單因素COX分析了4個(gè)基因突變，TMB和DNNs與DCB的關(guān)系，只有TMB與DNNs與DCB顯著相關(guān)；還比較DNNs模型和結(jié)合了4個(gè)基因和TMB(+PD-L1)的多變量模型的預(yù)測效果，DNNs模型預(yù)測效果均比其他兩種模型更好。作者還發(fā)現(xiàn)DNNs預(yù)測不同的免疫療法，以及在不同的EGFR突變狀態(tài)下的預(yù)測能力都是穩(wěn)健的。

圖2.d顯示訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中大多數(shù)C1組患者對(duì)免疫治療反應(yīng)較好(DCB)，C2組患者對(duì)免疫治療反應(yīng)較差(NDB)。對(duì)于接受抗PD-1 / PD-L1治療的患者，與C2組相比，DNN的C1組表現(xiàn)出更好的OS和PFS，并在驗(yàn)證集中得到了驗(yàn)證（圖3）。最后作者納入其他臨床因素和遺傳因素進(jìn)行單變量和多因素COX分析，證實(shí)了DNNs模型是抗PD-1 / PD-L1治療預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。

2.C1組中有更多的免疫細(xì)胞浸潤和IFNγ相關(guān)基因的表達(dá)

基于DNNs分析，作者將具有WES和RNAseq數(shù)據(jù)的TCGA-LUAD隊(duì)列(n=510)分為兩個(gè)亞組(C1=176；C2=334)。首先通過確定22種免疫細(xì)胞中免疫相關(guān)的mRNAs表達(dá)水平來研究C1組與TME之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)參與炎癥反應(yīng)和IFNγ途徑的mRNA在C1組中顯著富集（圖4.a）。在TCGA-LUAD的免疫相關(guān)基因中，CD8A、CD3D和CD4在C1組中顯著上調(diào)（圖4.b），與活化的效應(yīng)T細(xì)胞和IFNγ途徑有關(guān)的基因，如STAT1、CCL4、CXCL9、CXCL10，TBX21和IFNG也顯著上調(diào)（圖4.ab）。

接著，作者采用CIBERSORT分析了每個(gè)腫瘤樣本中22種免疫細(xì)胞類型的相對(duì)豐度(圖4.c)，發(fā)現(xiàn)C1組表現(xiàn)出更多的腫瘤浸潤C(jī)D8+CTL。同樣地，在C1組中，活化的NK細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，這些細(xì)胞可能有助于提高抗腫瘤免疫應(yīng)答。在C2組中，M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，可能與抗PD-1治療的無效應(yīng)答有關(guān)(圖4.d)。

3.DNNs分類與PD-L1表達(dá)、免疫表型的相關(guān)性

作者接下來評(píng)估了來自TCGA-LUAD的RNA-Seq表達(dá)數(shù)據(jù)，并研究了C1/C2與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性。免疫檢查點(diǎn)的平均mRNA表達(dá)如圖5.a所示，PD-1、PD-L1、PD-L2、 LAG3、VTCN1、IDO1和TIM3在C1組中富集。C1組的PD-L1mRNA和蛋白(來自TCGA反相蛋白芯片RPPA分析)表達(dá)顯著增高，利用MSKCC隊(duì)列中的PD-L1免疫組織化學(xué)(IHC)評(píng)分，進(jìn)一步證實(shí)了C1組PD-L1的高表達(dá)。(圖5.b)

為了確定DNNs預(yù)測抗PD-1/PD-L1治療反應(yīng)的能力，作者使用免疫表型分析來研究免疫表型評(píng)分(IPS)與 C1/C2組之間的相關(guān)性。免疫表型圖(圖5.c)顯示了TCGA中四種類型(CTLA4_negative+ PD-1_negative，CTLA4_positive + PD-1_negative, CTLA4_negative + PD-1_positive, CTLA4_positive + PD-1_positive)的IPS，IPS即基于腫瘤免疫重要的成份表達(dá)情況進(jìn)行打分，包括MHC分子、免疫調(diào)節(jié)因子、效應(yīng)細(xì)胞和抑制性細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)，在PD-1_neg+CTLA4_neg中， C1組的IPS低于C2組。有趣的是， 在PD-1_neg+CTLA4_pos和CTLA4_pos+PD-1_pos中，C1組IPS顯著升高(圖5.d)。這些結(jié)果表明，C1組患者對(duì) 抗PD-1/PD-L1治療或抗PD-1/PD-L1和抗CTLA4聯(lián)合治療均有較好的反應(yīng)。

接著作者在TCGA-LUAD隊(duì)列分析了DNNs預(yù)測接受腫瘤切除、化療或放治而沒有免疫治療的的預(yù)測能力，C1和C2組的OS和無病生存期(DFS)沒有顯著差異 (圖5.e)。

4.C1和C2組具有顯著差異的腫瘤突變負(fù)荷和突變譜

雖然TMB和DNNs都涉及到體細(xì)胞突變，但LUAD患者中的DNNs與TMB的關(guān)系尚不清楚。作者對(duì)三個(gè)獨(dú)立的隊(duì)列中的非同義突變與兩種DNNs分類(C1：n=75、52和 176；C2：n=108、111和334)進(jìn)行了比較。與C2組相比，C1組在Broad、TSP和TCGA隊(duì)列中均表現(xiàn)出更多的非同義突變。作者使用癌癥免疫組圖譜 Cancer Immunome Atlas(https:///home)預(yù)測新抗原的信息，在TCGA隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)C1組的新抗原多于C2組，這些均有助于增強(qiáng)C1組患者對(duì)抗PD-1/PD-L1治療的免疫反應(yīng)(圖6.a)。 

作者進(jìn)一步分析了C1組體細(xì)胞突變中四個(gè)堿基(A、 T、C和G)的突變特征。在顛換transversions(T>A、C>G、C>A和T>G)和轉(zhuǎn)換transitions(A>G和C>T)中，C1 組的轉(zhuǎn)換和顛換都顯著高于C2組(圖6.b)。作者也研究了這兩個(gè)隊(duì)列的突變譜狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)C>A顛換頻率的增加、C>T轉(zhuǎn)換頻率的降低與C1組中的高突變顯著相關(guān)，這一結(jié)果在 TCGA-LUAD隊(duì)列中得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證(圖6.c,d)。最后作者計(jì)算了Broad和TCGA隊(duì)列中每個(gè)樣本的transversions和transitions(Tv/Ti)比率，并觀察到C1組具有較高的Tv/Ti(圖6.c,d)，而已知transversions更可能會(huì)改變氨基酸序列，從而導(dǎo)致翻譯蛋白的突變。