今天給同學(xué)們分享一篇關(guān)于自噬與免疫治療的生信文章“The Comprehensive Analysis Identified an Autophagy Signature for the Prognosis and the Immunotherapy Efficiency Prediction in Lung Adenocarcinoma”，這篇文章于2022年4月22日發(fā)表在Front Immunol期刊上，影響因子為8.786。研究確定了一種新的基于自噬的特征，可以預(yù)測肺腺癌（LUAD）患者的預(yù)后，該ATscore在檢查點(diǎn)治療效率預(yù)測中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1. 自噬調(diào)節(jié)基因的共識(shí)聚類預(yù)測LUAD患者的預(yù)后

為了探索自噬調(diào)節(jié)基因的預(yù)后相關(guān)性，九個(gè)具有可用生存數(shù)據(jù)的GEO數(shù)據(jù)集（GSE13213、GSE14814、GSE30219、GSE31210、GSE37745、GSE50081、GSE68465、GSE72094和GSE81089）和TCGALUAD數(shù)據(jù)集被招募為元隊(duì)列以構(gòu)建自噬調(diào)節(jié)基因共識(shí)聚類。通過單因素COX生信分析，選擇了38個(gè)P<0.001的調(diào)節(jié)劑進(jìn)行進(jìn)一步分析。R包Consensus集群Plus根據(jù)自噬調(diào)節(jié)基因的表達(dá)模式將LUAD樣本聚類為亞組。作者的共識(shí)矩陣結(jié)果表明，LUAD元隊(duì)列可以明顯分為兩個(gè)亞組，并且這些調(diào)節(jié)劑在元隊(duì)列和TCGA隊(duì)列中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式（圖2A、C）。此外，在作者篩選簇之間的DEG后，相關(guān)性生信分析結(jié)果表明，由自噬調(diào)節(jié)基因區(qū)分的簇與已識(shí)別的DEG密切相關(guān)。

圖1 流程圖

圖2 自噬調(diào)節(jié)基因的共識(shí)聚類預(yù)測了LUAD患者的預(yù)后

之后，作者檢查了LUAD患者的兩個(gè)亞組是否有不同的預(yù)后。Kaplan-Meier生信分析結(jié)果顯示，在元隊(duì)列和TCGA隊(duì)列中，簇2的預(yù)后比簇1差（圖2B，D）。此外，作者執(zhí)行t-SNE來驗(yàn)證子組分配。作者的結(jié)果表明，這兩個(gè)簇被很好地分離，這38個(gè)自噬調(diào)節(jié)基因顯著地將腫瘤與正常組織分開（圖2E，F(xiàn)）。

2. 自噬簇的轉(zhuǎn)錄組特征

為了確定兩個(gè)自噬簇(ATcluster)之間的生物學(xué)行為差異，進(jìn)行了GSVA富集分析以發(fā)現(xiàn)潛在的功能多樣性。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)大量與免疫相關(guān)和自噬相關(guān)的途徑被富集（圖3A）。因此，作者進(jìn)一步研究了元隊(duì)列中免疫浸潤細(xì)胞的無監(jiān)督聚類。作者發(fā)現(xiàn)兩個(gè)ATclusters具有不同的T細(xì)胞相關(guān)浸潤聚類和腫瘤微環(huán)境評分的顯著差異（圖3B），這些結(jié)果也在TCGA隊(duì)列中得到證實(shí)。此外，兩個(gè)簇中免疫相關(guān)基因的表達(dá)存在顯著差異。由于T細(xì)胞浸潤和腫瘤微環(huán)境重塑對于PD-1靶向治療至關(guān)重要，這些結(jié)果表明作者的自噬聚集與PD-1免疫治療的反應(yīng)之間存在潛在關(guān)聯(lián)。此外，這兩個(gè)自噬簇與元隊(duì)列和TCGA隊(duì)列中的眾所周知的特征相關(guān)（圖3C）。除了免疫浸潤外，自噬聚集還與LUAD腫瘤的增殖相關(guān)基因和代謝功能相關(guān)。

圖3 元隊(duì)列中自噬簇的轉(zhuǎn)錄組特征

3. 自噬修飾模式的構(gòu)建及其與LUAD患者預(yù)后和功能注釋的相關(guān)性

獲取并調(diào)整DEGs以研究兩個(gè)ATclusters的綜合生物學(xué)特征，并通過這些DEGs進(jìn)行共識(shí)聚類以構(gòu)建Geneclusters。同時(shí)，在共識(shí)聚類生信分析中使用的38個(gè)自噬調(diào)節(jié)因子被選擇用于TCGA隊(duì)列中的單因素COX生信分析。選擇P<0.05的20個(gè)調(diào)節(jié)劑作為自噬修飾模式候選者。此外，隨機(jī)生存森林生信分析用于探索自噬修飾模式構(gòu)建的概率。在計(jì)算了20個(gè)自噬調(diào)節(jié)因子的相對重要性后，7個(gè)基因被確定為最關(guān)鍵的因素（圖4A）。進(jìn)一步的對數(shù)秩生信分析表明，由3個(gè)基因（CCR2、ITGB1和DRAM1）構(gòu)建的簽名具有最低的P值，并且可以最有效地預(yù)測LUAD患者的預(yù)后（圖4B）。因此，作者將此基因特征命名為ATscore。不出所料，具有較高ATscore的LUAD患者在元隊(duì)列中的總生存率明顯更差（圖4C），Sankey圖顯示了ATclusters、Geneclusters、ATscores和患者生存率之間的相互聯(lián)系（圖4D）。ROC曲線顯示ATscore可以成為LUAD患者3年總生存率的敏感指標(biāo)。同時(shí)，ATscore的AUC大于其他報(bào)告的模型。此外，單因素和多因素COX回歸生信分析均顯示ATscore是LUAD患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。除了LUAD隊(duì)列，作者還調(diào)查了泛癌隊(duì)列，以探索自噬特征評分是否可以預(yù)測其他癌癥患者的生存率。作者的結(jié)果表明，ATscore的預(yù)測值可以在多個(gè)癌癥隊(duì)列中得到證實(shí)。總之，作者的分析構(gòu)建了一個(gè)稱為ATscore的新特征，該特征與LUAD患者的預(yù)后相關(guān)，可以作為LUAD患者的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。

圖4 ATscore的構(gòu)建及其預(yù)后預(yù)測價(jià)值的驗(yàn)證

為了確認(rèn)ATscore在LUAD患者中的生存預(yù)測價(jià)值，作者在由湘雅醫(yī)院胸外科的70例LUAD腫瘤樣本組成的獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列中驗(yàn)證了ATscore的預(yù)后價(jià)值。進(jìn)行IHC測定以確定ATscore相關(guān)基因的表達(dá)水平。因此，計(jì)算了這些腫瘤樣品的AT分?jǐn)?shù)。CCR2和DRAM1低表達(dá)水平和ITGB1高表達(dá)水平的樣本被分類為高ATscore組，反之亦然（圖4E）。Kaplan-Meier生信分析結(jié)果顯示，AT評分較高的患者的預(yù)后明顯低于AT評分較低的患者（圖4F）。這些結(jié)果驗(yàn)證了ATscore在作者的LUAD隊(duì)列中的預(yù)后預(yù)測價(jià)值。

為了進(jìn)一步研究自噬修飾特征的功能特征，對具有不同AT評分的患者進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組特征生信分析。GSVA生信分析結(jié)果表明，ATscores與T細(xì)胞選擇、T細(xì)胞譜系定型和其他體液免疫相關(guān)途徑相關(guān)（圖5A）。免疫浸潤細(xì)胞的進(jìn)一步無監(jiān)督聚類顯示ATscores與檢查點(diǎn)療法相關(guān)的免疫細(xì)胞具有更具體的相關(guān)性（圖5B）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了自噬特征與免疫相關(guān)基因之間的關(guān)系。同時(shí)，CNA生信分析結(jié)果顯示，不同ATscores的患者存在不同的拷貝數(shù)變化。ATscore高的患者KRTAP9-9擴(kuò)增和LCE3C缺失水平較高，ATscore低的患者PLK2擴(kuò)增水平較高。體細(xì)胞突變生信分析顯示，ATscore較高的患者的TP53、TTN、MUC16、CSMD3的突變頻率更高。此外，ATscores還與眾所周知的特征和致癌途徑密切相關(guān)（圖5C、D）。

圖5 TCGA隊(duì)列中具有各種AT評分的患者的轉(zhuǎn)錄組特征

4. ATScores與單細(xì)胞特性的相關(guān)性

根據(jù)LUAD腫瘤的T細(xì)胞浸潤與自噬特征之間的潛在相關(guān)性，作者通過探索單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)一步探討了ATscore是否可以預(yù)測單細(xì)胞特征。作者通過“infercnv”計(jì)算了單個(gè)細(xì)胞的CNV和每個(gè)細(xì)胞簇的CNV分?jǐn)?shù)。細(xì)胞分為惡性和非惡性細(xì)胞。此外，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，ATscores較低的腫瘤樣本的髓總祖細(xì)胞(CMP)、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例低于得分較高的腫瘤樣本(圖6A-C)。這些結(jié)果表明兩個(gè)ATscore組之間存在顯著的免疫微環(huán)境多樣性。

圖6 ATscores與單細(xì)胞特性的相關(guān)性

作者接下來關(guān)注具有不同ATscore的惡性細(xì)胞。通過不同水平的ATscores之間的DEG（圖6D），進(jìn)一步進(jìn)行了GO富集和GSEA測定。同時(shí)，作者通過GSVA生信分析比較了兩組之間的不同通路。作者的結(jié)果確定了兩個(gè)ATscore組在自噬和免疫反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞功能和信號(hào)通路方面的顯著差異（圖7A-C）。

圖7 ATscores與免疫細(xì)胞浸潤和細(xì)胞通訊模式的相關(guān)性

此外，作者探索了不同ATscore水平的腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境細(xì)胞之間的相互作用，結(jié)果還顯示了不同ATscore水平的腫瘤細(xì)胞之間的通信模式的多樣性。作者的研究結(jié)果表明，LUAD腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞可能通過PAR、IFN-II和IL-4途徑與高ATscore水平的惡性細(xì)胞交流，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力（圖7D-F）。

5. 自噬修飾模式預(yù)測免疫治療益處

在之前的研究中，作者研究了ATscore在LUAD隊(duì)列中的生存預(yù)測作用，并探討了ATscore與LUAD腫瘤免疫逃逸之間的潛在關(guān)系。本節(jié)重點(diǎn)介紹ATscore在PD-1阻斷治療中的直接效率預(yù)測值。最近，T細(xì)胞發(fā)炎的GEP和CYT正在成為PD-1阻斷療法的預(yù)測性生物標(biāo)志物。因此，作者探討了ATscores與這些眾所周知的生物標(biāo)志物之間的相關(guān)性。作者的結(jié)果顯示，TCGA隊(duì)列中AT評分較低的患者GEP和CYT評分相對較高（圖8A、B）。此外，還進(jìn)行了TIDE算法來評估ATscores和LUAD腫瘤免疫治療反應(yīng)的一致性。作者的結(jié)果顯示，TCGA隊(duì)列中ATscore較高的患者對免疫治療的反應(yīng)可能較差（圖8C）。這些生物標(biāo)志物計(jì)算表明ATscores可能與免疫治療反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。此外，作者發(fā)現(xiàn)ATscores水平與IMvigor210隊(duì)列中的PD-1阻斷治療反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。在該隊(duì)列中，AT評分較高的患者的抗PD-1反應(yīng)和預(yù)后也比評分較低的患者差（圖8D）。此外，作者評估了具有不同AT評分的LUAD患者的化療反應(yīng)。作者的結(jié)果表明，與ATscore較低的患者相比，ATscore較高的患者在許多化療分子中的IC50值顯著升高，尤其是在肺癌敏感的AZD6244和吉非替尼中。這些結(jié)果表明，ATscore較高的患者的化療反應(yīng)也可能比ATcores較低的患者更差。

圖8 自噬特征預(yù)測免疫治療益處

6. DRAM1抑制LUAD細(xì)胞的增殖和遷移

在構(gòu)成ATscore的三個(gè)自噬調(diào)節(jié)因子中，CCR2和ITGB1被廣泛討論并被認(rèn)為是LUAD發(fā)展中的重要調(diào)節(jié)因子。然而，DRAM1的生物學(xué)功能仍然存在爭議。為了驗(yàn)證作者預(yù)測的DRAM1在ATscore中的腫瘤抑制作用，作者使用siRNA來抑制A549和H1299細(xì)胞中DRAM1的表達(dá)（圖9A）。CCK-8生信分析、EdU生信分析和集落形成生信分析表明，DRAM1的抑制顯著促進(jìn)了LUAD細(xì)胞的增殖和DNA復(fù)制能力（圖9B-D）。同時(shí)，Transwell檢測和侵襲檢測的結(jié)果表明，DRAM1表達(dá)的抑制顯著增強(qiáng)了LUAD細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖9E）。這些結(jié)果表明DRAM1在LUAD細(xì)胞中起到腫瘤抑制因子的作用，并驗(yàn)證了其在ATscore中的保護(hù)作用。

圖9 DRAM1抑制LUAD細(xì)胞的增殖和遷移能力