一、文章背景

癌癥是由一系列體細(xì)胞基因突變積累推動(dòng)癌細(xì)胞增殖所導(dǎo)致的遺傳性疾病。浸潤(rùn)性乳腺癌是含有多種分子亞型的異質(zhì)性癌癥。約12-20%的浸潤(rùn)性乳腺癌出現(xiàn)HER2基因擴(kuò)增，通常導(dǎo)致HER2蛋白過(guò)表達(dá)。接受輔助化療和/或局部放療的浸潤(rùn)性乳腺癌淋巴結(jié)陰性/陽(yáng)性患者中，HER2擴(kuò)增與無(wú)病生存率和總體生存率的降低相關(guān)。隨著人源化單克隆抗HER2抗體trastuzumab(Herceptin)的出現(xiàn)，抗HER2治療藥物得到了極大的發(fā)展。

無(wú)論是原位癌還是浸潤(rùn)性癌，大多數(shù)HER2陽(yáng)性乳腺癌都表現(xiàn)出同質(zhì)性HER2過(guò)表達(dá)和擴(kuò)增，意味著其是推動(dòng)癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵分子。然而，腫瘤內(nèi)HER2異質(zhì)性擴(kuò)增的模式并不少見(jiàn)，5-41%的HER2陽(yáng)性乳腺癌存在異質(zhì)性。對(duì)異質(zhì)性的觀察結(jié)果表明，在一些腫瘤中，并非所有癌細(xì)胞都依賴HER2癌基因，其他基因異?？赡艹蔀镠ER2陰性亞克隆中癌細(xì)胞增殖和侵襲的有效替代驅(qū)動(dòng)因子，如先前研究發(fā)現(xiàn)的BRF2和DSN1基因擴(kuò)增以及HER2 p.I767M體細(xì)胞突變。

二、分析流程

三、結(jié)果解讀

1.患者樣本

作者分析了10例HER2空間異質(zhì)性擴(kuò)增的乳腺癌樣本，其中8例為非特殊類(lèi)型的浸潤(rùn)性癌(NST)及相關(guān)導(dǎo)管原位癌(DCIS)，1例為浸潤(rùn)性小葉癌及相關(guān)的小葉原位癌(LCIS)，1例為梭形細(xì)胞型化生性癌及相關(guān)DCIS。詳細(xì)信息見(jiàn)表1。在一些患者中，HER2異質(zhì)性擴(kuò)增也與異質(zhì)性激素受體狀態(tài)相關(guān)。作者對(duì)所有患者都進(jìn)行了淋巴結(jié)分期，6例患者未發(fā)現(xiàn)前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者10出現(xiàn)7個(gè)腋窩淋巴結(jié)宏轉(zhuǎn)移，為靶向第二代測(cè)序(NGS)提供了充分的組織樣本?；颊?、9和5分別出現(xiàn)前哨淋巴結(jié)孤立腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、微轉(zhuǎn)移和宏轉(zhuǎn)移。由于可利用的腫瘤組織數(shù)量不足，作者并沒(méi)有分析這些轉(zhuǎn)移。

前哨淋巴結(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移分為三種：①孤立腫瘤細(xì)胞（ITC）---淋巴結(jié)中腫瘤細(xì)胞團(tuán)最大直徑≤0.2mm。②微轉(zhuǎn)移---腫瘤轉(zhuǎn)移灶最大直徑＞0.2mm但≤2mm。③宏轉(zhuǎn)移---腫瘤轉(zhuǎn)移灶最大直徑＞2mm。

2.覆蓋分析和突變分析

作者從所有組織（除兩個(gè)顯微切割組織樣本）中提取足夠的DNA，用含有53個(gè)基因的panel靶向NGS分析。在ARID1B, BRCA2, CCND3, CHECK2, ERBB2, ERBB3, MAP2K4, MLL, NCOR1, NOTCH1, PBRM1和PDGFRA中未發(fā)現(xiàn)致病或可能致病的體細(xì)胞突變，也沒(méi)有觀察到致病的生殖細(xì)胞突變。基于四種預(yù)測(cè)工具和COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)，作者在26個(gè)不同基因中鑒定到63個(gè)致病或可能致病的突變。如圖1所示，這些突變包括12種缺失，9種插入，32種錯(cuò)義突變，7種無(wú)義突變（引入終止密碼子）和3種剪接位點(diǎn)改變。且這些體細(xì)胞突變?cè)贏RID1A、MLL3、NF1、PIK3CA和TP53中常見(jiàn)。

靶向NGS分析發(fā)現(xiàn)了每個(gè)腫瘤成分體細(xì)胞突變?nèi)爸写嬖诘臐撛诋愘|(zhì)性。有些突變同質(zhì)性分布于每個(gè)腫瘤成分，如PIK3CA突變的7個(gè)腫瘤中有4個(gè)腫瘤是同質(zhì)性突變的；有些突變異質(zhì)性分布，如體細(xì)胞TP53突變，且與HER2的擴(kuò)增狀態(tài)無(wú)關(guān)。（表2）

• 70%（7/10）的乳腺癌中腫瘤抑制基因TP53至少發(fā)生一種突變，包括5種錯(cuò)義變異、3種缺失突變和1種剪接位點(diǎn)改變。其中，TP53在4、5和8號(hào)患者所有腫瘤成分中同質(zhì)性突變，在1、2、7和10號(hào)患者都出現(xiàn)一個(gè)TP53異質(zhì)性突變的腫瘤。如1號(hào)患者HER2-DCIS成分和HER2+浸潤(rùn)性成分中出現(xiàn)p.R248W TP53突變，HER2+DCIS組分出現(xiàn)p.Y234H TP53突變。

• 70%（7/10）的乳腺癌中含一種PIK3CA突變。患者1、4、5、7和9號(hào)每個(gè)腫瘤成分均存在同質(zhì)性PIK3CA突變，而患者3和6號(hào)的乳腺癌中PIK3CA呈異質(zhì)性突變分布。如3號(hào)患者HER2-浸潤(rùn)性成分中出現(xiàn)p.G1049R錯(cuò)義突變，DCIS成分中未檢測(cè)到，無(wú)論其HER2狀態(tài)如何。

單個(gè)腫瘤中HER2-/+成分的遺傳異質(zhì)性表明，大量不同的體細(xì)胞突變和/或CNVs可能是潛在的替代驅(qū)動(dòng)因子。這些突變可能會(huì)抵消HER2-成分中HER2擴(kuò)增的缺失。

作者還發(fā)現(xiàn)，其他不太常見(jiàn)的基因（AKAP9，ATM，BRCA1，CBFB，CDH1，EGFR，ESR1，F(xiàn)BXW7，GATA3，MAP3K1，MED12，MLL2，MLLT4，NFATC2，PTEN，RB1，RNF213，RUNX1，SF3B1，SPEN和TBX3）的體細(xì)胞突變通常在腫瘤中異質(zhì)性表達(dá)，且似乎與HER2擴(kuò)增狀態(tài)無(wú)關(guān)，除了GATA3突變。體細(xì)胞GATA3突變發(fā)生在HER2+腫瘤成分：患者2的HER2+原位成分和浸潤(rùn)性成分中出現(xiàn)GATA3突變，而在HER2-浸潤(rùn)性成分中未出現(xiàn)。患者3的HER2+LCIS成分中出現(xiàn)GATA3剪接位點(diǎn)突變，而在HER2-原位和侵襲性成分中未觀察到。

3.拷貝數(shù)變異分析

作者接下來(lái)研究了高水平的拷貝數(shù)變異CNVs（圖2-3），證實(shí)所有HER2+癌成分中均出現(xiàn)HER2擴(kuò)增，并將其作為內(nèi)部質(zhì)控。結(jié)果表明，患者1的HER2-DCIS成分中EGFR拷貝數(shù)增加，患者3的HER2-浸潤(rùn)性小葉癌出現(xiàn)FGFR1擴(kuò)增，而在HER2-/+的LCIS成分中不出現(xiàn)這種擴(kuò)增，患者5的所有腫瘤成分都出現(xiàn)FGFR1拷貝數(shù)增加。

分析發(fā)現(xiàn)，患者9和10的HER2-腫瘤成分均出現(xiàn)8q24擴(kuò)增，包括MYC和鄰近lncRNA PVT1拷貝數(shù)增加。已有研究將共擴(kuò)增的MYC和PVT1基因鑒定為ER2+HER2+乳腺癌的候選癌基因。且PVT1高表達(dá)與不良預(yù)后的臨床病理標(biāo)志有關(guān)，如更大的腫瘤體積、更高的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。體外研究也表明，PVT1表達(dá)通過(guò)促進(jìn)KLF5/BAP1/beta-catenin信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。

患者9的HER2-腫瘤成分中還出現(xiàn)CCND1拷貝數(shù)增加。在ER-HER2-淋巴結(jié)陰性的乳腺癌患者中，CCND1擴(kuò)增與特定的基因表達(dá)譜和生存率降低有關(guān)，表明CCND1擴(kuò)增也可能是癌變的一種替代驅(qū)動(dòng)因子。乳腺癌和其他類(lèi)型癌癥中的FGFR1擴(kuò)增也有類(lèi)似的報(bào)道。

4.補(bǔ)充免疫組化分析

作者對(duì)所有腫瘤組織樣本進(jìn)行EGFR免疫組化分析（圖4）：患者1中，HER2-DCIS成分中的EGFR擴(kuò)增與EGFR蛋白過(guò)表達(dá)有關(guān)，其他腫瘤中未發(fā)現(xiàn)EGFR蛋白過(guò)表達(dá)。而3號(hào)和5號(hào)患者的腫瘤組織樣本中免疫組化分析結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR1在兩種腫瘤成分均不出現(xiàn)明顯陽(yáng)性(數(shù)據(jù)未顯示)。