一.研究背景

最近，對(duì)多種癌癥的多組學(xué)分析為癌癥的基因組學(xué)，表觀基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)失調(diào)提供了新的視角。由DNA拷貝數(shù)變異（CNV）和單核苷酸變異（SNV）引起的基因組異常在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中很常見(jiàn)。對(duì)基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和臨床信息的綜合分析有助于鑒定特定的分子亞組并發(fā)現(xiàn)胰腺癌的新生物標(biāo)志物。

二.分析流程

三.結(jié)果解讀

1.CNVcor和METcor基因數(shù)據(jù)集之間的比較

作者從TCGA收集了CNV，DNA MET、RNA-Seq（HTSeq計(jì)數(shù)類(lèi)型）以及SNV數(shù)據(jù)，用于進(jìn)一步分析。

為了建立CNVcor和METcor基因，作者分別計(jì)算了每個(gè)基因與CNV / MET數(shù)據(jù)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，總共獲得了2445個(gè)CNVcor基因和3729個(gè)METcor基因。

• 從Z值分布情況來(lái)看：CNVcor基因的相關(guān)性向右移動(dòng)，而METcor基因的相關(guān)性向左移動(dòng)（圖1A）。

由于CNVcor和METcor數(shù)據(jù)集中的基因數(shù)量眾多，作者僅在每個(gè)數(shù)據(jù)集中選擇與OS顯著相關(guān)的基因。最終獲得了201個(gè)CNVcor基因和295個(gè)METcor基因用于進(jìn)一步分析。

• CNVcor和METcor之間沒(méi)有明顯的交集，只有34個(gè)基因重疊（圖1B）。

• CNVcor基因的染色體分布表明CNVcor基因在chr12，chr8和chr17上最為豐富（圖1C和表1）。

• METcor基因主要分布在chr1，chr2，chr3，chr7，chr11，chr12和chr17上，但在chr18上幾乎沒(méi)有分布（圖1D和表2）。

• METcor基因的主要功能是蛋白質(zhì)編碼（圖1E），且主要位于CpG島區(qū)域（圖1 F）。

2.鑒定CNVcor和METcor基因數(shù)據(jù)集亞型

作者使用NMF（非負(fù)矩陣分解）對(duì)CNVcor和METcor數(shù)據(jù)集進(jìn)行聚類(lèi)，并使用NMF的“ brunet”方法進(jìn)行了50次迭代。經(jīng)分析，兩者最佳聚類(lèi)數(shù)都為4（CNVcor：圖2A；METcor：圖2B）。

圖2C：CNVcor數(shù)據(jù)集的四個(gè)亞型在OS上顯示出顯著差異。

圖2D：在METcor數(shù)據(jù)集的四個(gè)亞型中，OS也存在顯著差異。

圖2E-F：觀察到CNVcor亞型和METcor亞型之間存在明顯的重疊。

3.基于CNV，MET和EXP數(shù)據(jù)的整合鑒定了胰腺癌樣本四個(gè)亞組

圖3A-B：作者基于CNVcor 、 METcor基因和EXP（mRNA表達(dá)）數(shù)據(jù)，使用R包 iCluster將收集到的胰腺癌樣本聚類(lèi)。所有樣本被分為四組，包括iC1（18個(gè)樣本），iC2（48個(gè)樣本）， iC3（48個(gè)樣本）和iC4（53個(gè)樣本）。

圖3C：KM分析表明，四個(gè)亞組之間OS存在顯著差異。

圖3D：OS預(yù)后最好的iC1與其他三個(gè)亞組之間的進(jìn)一步KM分析表明，iC1和iC4之間的差異最為顯著。

圖3E：四個(gè)亞組之間的PFS也顯示出部分差異。

4.CNV和MET變化之間的相關(guān)性

為了研究CNV與MET畸變之間的關(guān)系，將CNV數(shù)據(jù)分為CNV gain（β值> 0.3）和CNV loss（β值<-0.3），并將MET數(shù)據(jù)分為高甲基化（MetHyper，β -值> 0.8）和低甲基化（MetHypo，β值<0.2）。分別記錄每個(gè)樣品的CNV gain值、CNV loss值以及MetHyper、MetHypo。

圖4A：CNV gain與CNV loss之間存在顯著的正相關(guān)性；

圖4B：CNV gain與MetHyper正相關(guān)；

圖4C：但CNV gain與MetHypo之間的相關(guān)性不顯著；

圖4D：CNV loss與MetHyper之間的相關(guān)性也呈顯著正相關(guān)；

圖4E：但是，CNV loss與MetHypo之間沒(méi)有顯著相關(guān)性；

圖4F：MetHyper和MetHypo具有顯著的負(fù)相關(guān)性。

5.胰腺癌亞群的臨床病理特征和免疫評(píng)分

作者進(jìn)一步分析了iC1和iC2 / iC3 / iC4亞組之間的臨床病理信息。在iC1和iC2 / iC3 / iC4之間觀察到年齡和酒精暴露的顯著差異（表3）。

接下來(lái)，作者使用TIMER工具來(lái)計(jì)算四個(gè)亞組的免疫評(píng)分。

圖5A-B：除CD8 T細(xì)胞外，iC1亞組B細(xì)胞CD4 T細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞中的免疫評(píng)分均顯著高于的其他三個(gè)亞組。

圖5C：免疫特征分析還顯示，與其他三組相比，iC1亞組在巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)特征，IFN-γ反應(yīng)和TGF-β反應(yīng)方面得分更高。

以上結(jié)果表明iC1亞組可能處于免疫增強(qiáng)狀態(tài)，可能在一定程度上有助于iC1亞組的預(yù)后。

6.胰腺癌亞組分子特征的比較

為了分析四個(gè)亞組之間的不同分子特征，作者分別計(jì)算了iC1和iC2 / iC3 / iC4之間的差異表達(dá)基因（DEGs），最終獲得了817個(gè)DEGs。

接著作GO富集分析發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞活化，淋巴細(xì)胞活化調(diào)節(jié)，免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)細(xì)胞表面受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑等顯著富集（圖6D）。

然后，將DEGs的CNV數(shù)據(jù)分為CNV gain，CNV loss和CNV normal。將DEG的MET數(shù)據(jù)也分為三類(lèi)，包括MetHyper，MetHypo和MET normal。

• 圖6A：iC2和iC4的CNV異常顯著高于iC1和iC3，這表明CNV可能對(duì)胰腺癌的預(yù)后有一定影響；

• 圖6B：但是，未觀察到甲基化的顯著差異。

• 圖6C：從基因表達(dá)與甲基化和CNV之間的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)具有MetHypo的DEGs的基因表達(dá)水平更高，但在CNV之間未觀察到類(lèi)似的關(guān)系。基于這些結(jié)果，推測(cè)甲基化水平可能比CNV水平對(duì)DEGs的基因表達(dá)影響更大。

7.CNV，MET與基因表達(dá)之間的關(guān)系

為了進(jìn)一步分析CNV，MET和基因表達(dá)之間的關(guān)系，作者對(duì)817個(gè)DEGs進(jìn)行了單變量生存分析，并確定和選擇了與預(yù)后顯著相關(guān)的35個(gè)DEGs。使用來(lái)自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的外部GSE21501和GSE71729數(shù)據(jù)集來(lái)驗(yàn)證結(jié)果。

最后，在外部和內(nèi)部數(shù)據(jù)集中選擇了三個(gè)與胰腺癌預(yù)后相關(guān)的基因（GRAP2，ICAM3和A2ML1）。

• GRAP2（HR <1）和ICAM3（HR <1）是有利的預(yù)后因素，而A2ML1（HR> 1）是不利的預(yù)后因素（圖7：C＆D，G＆H，K＆L）。在三個(gè)基因中均觀察到了基因表達(dá)與MET之間的顯著負(fù)相關(guān)（圖7：A＆B，E＆F，I＆J），但與CNV沒(méi)有觀察到顯著相關(guān)。

8.胰腺癌亞組突變譜的比較

作者進(jìn)一步分析了iCluster聚類(lèi)的四個(gè)亞組的突變譜。確定了一組在iC1和iC2 / iC3 / iC4亞組之間具有顯著差異的基因，并根據(jù)Fisher檢驗(yàn)p值的排名選擇了前50個(gè)基因進(jìn)行展示（圖8A）。預(yù)后較差的iC2 / iC3 / iC4亞組中KRAS，CDKN2A和SMAD4基因的突變頻率顯著高于iC1亞組（p <0.05）。

圖8B：iC1亞組的沉默突變，非沉默突變和SNV新抗原的數(shù)量顯著少于iC2 / iC3 / iC4亞組。

圖8C：至于CNV gain和CNV loss數(shù)據(jù)，觀察到類(lèi)似的趨勢(shì)，即與iC2 / iC3 / iC4子組相比，iC1擁有更少的CNV突變;盡管四個(gè)亞組之間的MetHyper和MetHypo存在顯著差異，但未觀察到iC1和iC2 / iC3 / iC4亞組之間的顯著差異。

以上結(jié)果表明，基因組不穩(wěn)定對(duì)胰腺癌的預(yù)后有重要影響，突變率高和CNV異?？赡軐?dǎo)致預(yù)后不良。