二型糖尿病患者中牙周炎相關(guān)的齦下菌群

The ISME Journal [IF: 9.18]

DOI：https:///10.1038/s41396-019-0544-3

發(fā)表日期：2020-02-01

第一作者：Baochen Shi¹

通訊作者：Huiying Li^1,3

其他作者：Renate Lux², Perry Klokkevold², Michaela Chang², Emma Barnard¹, Susan Haake²

主要單位：

¹ 美國加州大學(xué)洛杉磯分校大衛(wèi)格芬醫(yī)學(xué)院克倫普分子成像研究所(Department of Molecular and Medical Pharmacology, Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, CA, USA)

² 美國加州大學(xué)洛杉磯分校牙學(xué)院（Section of Periodontics, School of Dentistry, University of California, Los Angeles, CA, USA）

³ 美國加州大學(xué)洛杉磯分校UCLA-DOE基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究所（UCLA-DOE Institute for Genomics and Proteomics, University of California, Los Angeles, CA, USA）

摘要

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)常伴發(fā)牙周炎。齦下菌群是牙周炎發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素，但其在T2DM人群中的特點(diǎn)還不夠明確。為了更好地了解T2DM患者和非糖尿病(nondiabetic, ND)者的齦下菌群的差異，本研究對T2DM患者(n=15)和ND受試者(n=16)(兩組均包括牙周健康者、牙周炎者)的齦下微生物組進(jìn)行了縱向分析。采用宏基因組鳥槍法測序，研究了牙周健康、牙周炎治療前后的菌群特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管兩組的臨床狀況相似，ND組中牙周炎患者和牙周健康者的差異比T2DM組明顯。此外，該研究發(fā)現(xiàn)致病菌的相對豐度不僅在牙周炎狀態(tài)下高度相關(guān)，而且在T2DM的牙周健康狀態(tài)下也是如此，這可能與牙周炎的進(jìn)展有關(guān)。通過進(jìn)一步研究齦下微生物的功能通路，確定了一組與臨床狀態(tài)相關(guān)的微生物標(biāo)記基因。這些基因在21條通路中顯著富集，其與牙周炎有關(guān)，同時(shí)也可能是T2DM和牙周炎之間的關(guān)聯(lián)因子。本研究證實(shí)了T2DM患者與牙周炎相關(guān)的齦下菌群的縱向變化，提示T2DM患者更容易出現(xiàn)齦下菌群的生態(tài)失調(diào)，這可能是由于宿主代謝和免疫調(diào)節(jié)受損所致。

1 引言

糖尿病是一種全球發(fā)病率較高的全身性疾病。臨床證據(jù)表明，2型糖尿病(T2DM)增加了患牙周炎等炎癥性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，美國有一半的成年人都患有牙周炎。糖尿病與宿主代謝失調(diào)有關(guān)，它能夠上調(diào)炎癥反應(yīng)并促進(jìn)組織破壞，而牙周炎癥不利于血糖控制。炎癥是糖尿病和牙周炎之間重要的關(guān)聯(lián)因子。臨床和動(dòng)物模型研究表明，IL-1β、TNF-α、RANKL等細(xì)胞因子可能是糖尿病與牙周炎之間重要的關(guān)聯(lián)因子。晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)及其受體RAGE之間的相互作用可能會增加糖尿病患者的炎癥和牙周組織破壞。最近的一項(xiàng)小鼠模型實(shí)驗(yàn)研究表明，糖尿病通過促炎細(xì)胞因子IL-17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)增加了口腔微生物群的致病性。糖尿病患者的免疫反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致齦下微生物群失調(diào)，從而使宿主易患牙周炎。

齦下菌群在牙周炎發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。多個(gè)研究通過16S rRNA基因分析，確定了全身健康的非糖尿病(ND)受試者齦下微生物群的分類組成。這些研究揭示了健康牙周狀態(tài)和牙周炎狀態(tài)下的齦下菌群的顯著差異，并表征了牙周治療后菌群的縱向變化。此外，基于宏基因組鳥槍法測序分析了ND受試者齦下菌群中的潛在功能，揭示了與牙周炎相關(guān)的幾個(gè)毒力因子和代謝途徑。

雖然在一些病例對照研究中用16S rRNA分析了T2DM患者齦下菌群的分類組成，但缺乏治療前后與牙周炎相關(guān)的齦下菌群的縱向分析。微生物在不同狀態(tài)下的功能組成以及與ND中微生物群的比較還沒有被研究過。本研究首次對T2DM患者牙周健康、牙周炎和牙周炎治療后齦下微生物組進(jìn)行了宏基因組鳥槍測序分析。確定了菌群組成和細(xì)菌間的相關(guān)性，并分析了與T2DM牙周炎相關(guān)的潛在微生物的功能通路。另外還比較了T2DM患者和ND患者不同狀態(tài)下的齦下菌群特點(diǎn)。

2 材料與方法

2.1 患者納入與臨床檢查

Subject recruitment and sample collection

對于每個(gè)參與者，在第一次就診時(shí)都進(jìn)行了初步的全口檢查，以評估牙周的臨床指標(biāo)，包括牙齦指數(shù)GI、牙齦退縮GR、附著水平AL、牙周探診深度PD和探診出血BOP。每位牙周炎患者需要就診兩次。在第一次評估中，探診深度≥5mm，牙齦指數(shù)≥1，并且在探診時(shí)有出血，均被認(rèn)為是患病位點(diǎn)。在第一次治療前的第二次就診期間，對患病位點(diǎn)進(jìn)行采樣。治療包括牙周機(jī)械治療(刮治和根面平整)，不使用抗生素。在基礎(chǔ)治療后4-7周的第三次臨床隨訪中，對至少一個(gè)牙周炎癥消除的位點(diǎn)(PD≤4mm，探診時(shí)無出血或其他炎癥表現(xiàn))重新取樣進(jìn)行微生物群落分析。對于每個(gè)牙周健康的受試者（PD≤4mm，BOP%≤10-15）在初次評估后的第二次就診期間，抽取一個(gè)無探診出血的位點(diǎn)進(jìn)行取樣分析。本研究將6個(gè)月內(nèi)接受抗生素治療或有吸煙史的受試者排除在外。大部分樣本(83%)取自T2DM和ND受試者的磨牙或前磨牙部位。所有受試者在隨訪前都被要求在取樣前48小時(shí)不要漱口，在取樣前24小時(shí)不要采取任何口腔衛(wèi)生措施。

T2DM和ND組牙周炎患者或牙周健康的受試者在性別上是匹配的(表1)。T2DM牙周炎患者與ND牙周炎患者之間(p=0.29)、T2DM牙周炎患者與健康牙周者之間(p=0.43)、ND牙周健康者與牙周炎患者之間(p=0.42)的平均年齡無顯著性差異。但是T2MD牙周健康與ND牙周健康組年齡有顯著差異(p=0.021)。對所有受試者治療前后都進(jìn)行了糖化血紅蛋白(HbA1c)測定。在我們的T2DM隊(duì)列中，糖化血紅蛋白(HbA1c)水平在牙周治療前后無顯著性差異(p=0.36)。所有ND患者的HbA1C<6。

表1. 納入人群的人口學(xué)特點(diǎn)和臨床特點(diǎn)（PD，取樣位點(diǎn)的探診深度；BOP，探診出血）

Table 1 Demographic and clinical data of the study participants

2.2 樣本采集與DNA提取

Genomic DNA extraction

用無菌刮匙收集齦下菌斑，直接懸浮ATL緩沖液中。使用細(xì)菌裂解液處理，然后采用QIAamp微量DNA提取試劑盒提取基因組DNA。提取的基因組用EB緩沖液洗脫，短期(1周內(nèi))在?20°C保存，長期保存在?80°C。

2.3 測序與數(shù)據(jù)清理

Sequencing and data cleaning

進(jìn)行鳥槍法宏基因組測序，首先使用Nextera XT DNA Library Prep試劑盒制備測序文庫，然后使用100 bp成對末端讀長的鳥槍法在Illumina HiSeq測序平臺2000和2500對文庫進(jìn)行測序。在分析之前，對所有序列數(shù)據(jù)進(jìn)行清理。通過Bowtie2將序列映射到人類基因組，并使用BMTagger去除人類序列。低于20的低質(zhì)量堿基被修剪掉。如果兩個(gè)片段中的任何一個(gè)被修剪到小于60bp或具有≥3%的不確定堿基，則該片段被移除。使用CutAdapt修剪NextEra接頭和引物序列。

2.4 微生物組的分類和功能組成分析

Analyses of taxonomic and functional compositions of the microbiome

本研究采用了Schloissnig等人的方法，確定齦下微生物組的分類組成。使用Bowtie2將宏基因組序列與微生物參考基因組進(jìn)行比對。為了提高的映射分辨率和效率，本研究構(gòu)建了一個(gè)由124個(gè)屬375個(gè)種組成的泛基因組非冗余基因組集。來自人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫HOMD和Genbank的1309個(gè)人類口腔細(xì)菌基因組被納入泛基因組。使用了80%的序列相似性作為閾值，并要求至少80%的基因組被測序序列所覆蓋。通過計(jì)算覆蓋全基因組的堿基對的數(shù)量，然后轉(zhuǎn)化為物種平均基因組大小，計(jì)算出每個(gè)樣本中的細(xì)菌的豐度。

使用基于基因序列相似性的BLAST法比對KEGG數(shù)據(jù)庫（KO）和毒力因子數(shù)據(jù)庫VFDB注釋微生物功能基因。KO基因的豐度是通過將所有已鑒定物種的泛基因組中被注釋為KO基因的微生物基因的堿基個(gè)數(shù)相加而以拷貝數(shù)計(jì)算的。然后根據(jù)每個(gè)樣本的物b基因長度和測序深度(每108個(gè)微生p)對KO基因的相對豐度進(jìn)行轉(zhuǎn)化。我們用超幾何分布檢驗(yàn)確定了KO基因富集的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并對不同臨床狀態(tài)的KO基因在微生物途徑中的不同患病率進(jìn)行了分析。如果一條途徑由五個(gè)以上已鑒定的KO基因組成，則認(rèn)為該途徑存在。在不同臨床狀態(tài)下，至少有一半的樣本顯著富集(p<0.05)。

2.5 微生物組指標(biāo)

Microbiome index

該研究使用微生物組指數(shù)來定量比較不同臨床狀態(tài)下的齦下微生物組。本研究將每個(gè)樣本中所有已鑒定細(xì)菌的相對豐度與從ND受試者獲得的數(shù)據(jù)集中細(xì)菌豐富度的平均值進(jìn)行了比較。然后，根據(jù)每個(gè)細(xì)菌的統(tǒng)計(jì)分?jǐn)?shù)，使用以下公式計(jì)算微生物群指數(shù):

MI是微生物組指數(shù)，X_g是樣本中物種(g)的相對豐度，μ_1g和μ_2g是來自獨(dú)立數(shù)據(jù)集的處于牙周炎狀態(tài)和治療后的細(xì)菌(g)的相對豐度的平均值，t_gi是在兩種臨床狀態(tài)下比較物種相對豐度時(shí)的加權(quán)因子(g)。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

Statistical analysis

在QIIME中進(jìn)行基于加權(quán)UniFrac距離和主坐標(biāo)分析(PCoA)的微生物群落相似性分析。微生物群落變化的非參數(shù)多變量分析(ANOSIM)使用Mothur完成，以檢驗(yàn)組內(nèi)的微生物群相似性是否與組間的相似性顯著不同。組與組之間的統(tǒng)計(jì)比較采用雙側(cè)分布的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，縱向配對樣本采用配對的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。在R中使用p.adjust對多重比較p值進(jìn)行校正。根據(jù)物種在樣品中的相對豐度，利用Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算了不同臨床狀態(tài)下物種間的相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)果

Sample and data collection

本研究招募了32名受試者，被分成四組：T2DM合并慢性牙周炎(n=8)或牙周健康(n=8)，以及ND患者(n=8)慢性牙周炎或牙周健康(n=8)(表1)。對于每個(gè)牙周炎患者，在治療前(牙周炎狀態(tài))和在治療后(炎癥消退)進(jìn)行齦下菌斑樣本的采集和測序。對于每個(gè)牙周健康的受試者，一個(gè)齦下樣本(健康狀態(tài))被測序。所有樣本均采宏基因組鳥槍法進(jìn)行測序和分析。一名牙周健康的2型糖尿病受試者因?yàn)閬碜匀梭w的序列較多，最終未納入分析。最終，從47份樣品中獲得937億個(gè)堿基的微生物序列，平均每個(gè)樣品20億個(gè)堿基(2 GB)。

3.1 T2DM和ND患者不同牙周狀態(tài)下齦下菌群的差異

Changes in the subgingival microbiome among different periodontal states in T2DM and ND subjects

比較了T2DM和ND受試者不同牙周狀態(tài)下齦下菌群的組成。本研究的數(shù)據(jù)集中共鑒定出45個(gè)菌屬129個(gè)菌種。通過研究微生物與臨床狀態(tài)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在T2DM和ND中，齦下微生物群在牙周炎治療后和健康狀態(tài)之間沒有顯著差異(圖1)，表明牙周炎治療后的齦下微生物群與健康狀態(tài)非常相似。ND組牙周炎狀態(tài)下的齦下菌群與健康狀態(tài)下的菌群有顯著性差異(P<0.001)，這與以前的研究結(jié)果一致，說明ND牙周炎狀態(tài)下的齦下菌群與健康狀態(tài)下的菌群有顯著差異(P<0.05)。而T2DM患者的疾病狀態(tài)與健康狀態(tài)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性(p=0.26)(圖1)。

圖1.T2DM患者與ND受試者不同牙周狀態(tài)的齦下菌群比較。基于加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析顯示，T2DM和ND患者的健康狀態(tài)和牙周炎治療后之間均無顯著性差異，但T2DM組中牙周健康者與牙周炎患者的微生物組差異(p=0.001)小于ND組(p<0.26)。

Fig. 1 Subgingival microbiome comparison among periodontal states in T2DM and ND subjects. Principal coordinate analysis (PCoA) based on weighted UniFrac distance shows no significant difference between the healthy state and resolved state in both T2DM and ND subjects, however, the extent of the microbiome shift from the healthy to the periodontitis state was less in T2DM (p= 0.26) compared with ND subjects (p< 0.001).

為了更好地定量比較T2DM和ND的齦下微生物群及其與牙周炎的關(guān)系，我們根據(jù)基因組序列數(shù)據(jù)制定了一個(gè)“微生物組指數(shù)”來確定齦下微生物群的狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ND組中牙周炎狀態(tài)(中位數(shù)=0.6)與牙周炎治療后炎癥消除狀態(tài)(中位數(shù)=?0.49，p=0.0069)或健康狀態(tài)(中位數(shù)=?0.63，p=0.0003)之間的微生物指數(shù)有顯著性差異；而T2DM組中牙周炎狀態(tài)(中位數(shù)=?0.55)與牙周炎緩解狀態(tài)(中位數(shù)=?0.70，p=0.382)或健康狀態(tài)(中位數(shù)=?0.50，p=1)之間無顯著性差異。T2DM牙周炎組與ND牙周炎組也有所不同(p=0.08)(圖2)。這提示T2DM患者齦下菌群尚未完全轉(zhuǎn)變?yōu)镹D所見的“牙周致病性”狀態(tài)，但牙周組織已出現(xiàn)炎癥，臨床表現(xiàn)為牙周炎癥狀。

圖2.微生物組指數(shù)反映了不同牙周狀態(tài)以及T2DM和ND受試者之間齦下微生物組的差異。表示T2DM和ND受試者在每種臨床狀態(tài)下的微生物組指數(shù)。在T2DM牙周炎患者的菌群不如ND牙周炎患者齦下菌群的致病性高，而臨床均表現(xiàn)為牙周炎的特點(diǎn)，這表明T2DM患者更容易受到齦下微生物紊亂的影響。

Fig.2 The microbiome index indicates subgingival microbiome differences among periodontal states and between T2DM and ND subjects. The microbiome index was represented in a violin plot in each clinical state in T2DM and ND subjects. In T2DM, the microbiome in the periodontitis state had not shifted to the extent as observed in the disease state of ND subjects, while the periodontal tissue clinically manifested signs of periodontitis, suggesting that T2DM subjects are more susceptible to shifts in the subgingival microbiome toward the disease state.

3.2 2型糖尿病患者與健康者細(xì)菌組成及相關(guān)性的差異

Differences in the taxonomic composition and correlations among bacterial species between T2DM and ND subjects

在個(gè)體齦下微生物的水平上評估了T2DM和ND受試者之間的微生物群差異?？偣卜治隽?1個(gè)平均相對豐度大于1%的細(xì)菌，它們在不同臨床狀態(tài)組至少兩個(gè)樣本中相對豐度大于1%(圖3)。本研究對ND受試者的結(jié)果與之前基于16S rRNA 基因序列的研究一致，并且精確到了種水平。在ND組的牙周炎患者菌群中有15個(gè)種顯著較其他兩組更豐富，包括由Scransky等人定義的紅色復(fù)合體的牙周致病菌(牙齦卟啉單胞菌、福賽坦氏菌、齒垢密螺旋體)和橙色復(fù)合體中潛在的條件致病菌(具核梭桿菌、直腸彎曲桿菌、中間普氏菌和變黑普氏菌)，其中還包括Filifactor alocis。另外，ND組牙周健康狀態(tài)下有5種物種的數(shù)量顯著增加，包括黃色復(fù)合體中的鏈球菌(S.sanguinis、S.gordonii和S.oralis)、紫色復(fù)合體(小韋榮氏菌)和齲齒羅氏菌(Rothia Dentocariosa)。相反，在T2DM患者中，雖然檢出率高的菌種與ND組表現(xiàn)出相似的趨勢，但在相對豐度上沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與上述微生物群落水平上的發(fā)現(xiàn)一致。

圖3.不同牙周臨床狀態(tài)T2DM組與ND組患者齦下細(xì)菌相對豐度的比較。圖中顯示了T2DM和ND不同臨床狀態(tài)下51種細(xì)菌的平均相對豐度。在ND組中，右側(cè)紅色條帶顯示的15種細(xì)菌在牙周炎狀態(tài)下顯著多于健康狀態(tài)，而綠色條帶顯示的5種細(xì)菌在牙周炎狀態(tài)下顯著低于健康狀態(tài)。在T2DM組中，牙周炎和健康狀態(tài)之間的差異與ND組的趨勢相似，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig. 3 Comparison of the relative abundances of the prevalent subgingival bacterial species among clinical states and between T2DM and ND subjects. The average relative
abundances of the 51 prevalent bacterial species are shown for each clinical state in T2DM and ND. In ND, 15 species indicated by the red bar on the right were significantly more abundant in periodontitis state than in the healthy state, while five species indicated by the green bar were significantly less abundant. In T2DM, the differences between
the periodontitis and healthy states had a similar trend as seen in ND, but none of the species differed with statistical significance.

牙周炎是一種多種細(xì)菌引起的疾病?；诓煌乐芗疤悄虿顟B(tài)下細(xì)菌相對豐度的相關(guān)性，研究了細(xì)菌間潛在的相互作用(圖4)。細(xì)菌復(fù)合體(complex species)在相對豐度上高度相關(guān)，在T2DM和ND組牙周炎狀態(tài)下，它們都形成了一個(gè)緊密相關(guān)的細(xì)菌簇(圖4a-d)。此外，在T2DM牙周健康者中(圖4C)，發(fā)現(xiàn)三種紅色細(xì)菌復(fù)合體中的兩種的相對豐度具有相關(guān)性，這表明與全身健康者相比，具有健康牙周的T2DM患者進(jìn)展為牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)更高。

圖4.齦下細(xì)菌間相對豐度的相關(guān)性

根據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算了高檢出率細(xì)菌之間相對豐度的相關(guān)性。在熱圖中，物種在水平軸和垂直軸上以相同的順序列出，彩色條表示基于Socransky命名的細(xì)菌復(fù)合體。熱圖上的黑框表示組成紅色復(fù)合體的細(xì)菌簇，物種之間的平均Pearson相關(guān)系數(shù)>0.7。對相關(guān)矩陣進(jìn)行層次聚類。

Fig. 4 Correlations in relative abundance between subgingival species. The correlations in relative abundance among prevalent species  were calculated based on Pearson correlation coefficients. In each heatmap, the species are listed in the same order in both horizontal and vertical axes, and the colored bars indicate the bacterial complexes based on Socransky’s designation. Black boxes in the heatmaps indicate the bacterial clusters that comprise red complex species with an average Pearson correlation coefficients >0.7 between the species. Hierarchical clustering was applied to the correlation matrices.

3.3 與牙周炎和糖尿病相關(guān)的齦下菌群的功能通路

Functional potentials of the subgingival microbiome associated with periodontitis and diabetes

本研究比較了T2DM和ND患者齦下微生物組中編碼的潛在功能通路及其與牙周炎的關(guān)系。共鑒定了3,201個(gè)KO基因簇，這些基因都至少有一個(gè)拷貝。549個(gè)KO基因在不同臨床狀態(tài)的患病率不同，標(biāo)準(zhǔn)偏差>0.2。其中，373個(gè)KO基因(67.9%)來自Socransky等人定義的代表性細(xì)菌的基因組(圖5)。229個(gè)KO基因?qū)?yīng)于特定微生物復(fù)合體，而144個(gè)KO基因來自兩個(gè)或多個(gè)的微生物復(fù)合體。這些基于KO基因圖譜的發(fā)現(xiàn)與牙周炎微生物組指數(shù)中觀察到的結(jié)果是一致的(圖2)。與ND相比，紅色復(fù)合體的KO基因在T2DM牙周炎狀態(tài)中的分布較少。另一方面，在牙周健康狀態(tài)下，T2DM患者有更多橙色復(fù)合體的KO基因，這些基因通常被認(rèn)為是條件致病菌。綜上所述，本研究鑒定出一組指示不同牙周臨床狀態(tài)之間以及T2DM和ND之間微生物群差異的標(biāo)記基因。

圖5.KO基因在齦下菌群中的分布情況在不同牙周臨床狀態(tài)以及T2DM組與ND組之間的差異 共發(fā)現(xiàn)373個(gè)KO基因，它們在T2DM和ND組不同牙周臨床狀態(tài)中的檢出率不同。根據(jù)Socransky等人對細(xì)菌復(fù)合體的命名，右邊的色條表示KO基因所屬的細(xì)菌種類。棕色標(biāo)記的KO基因在該物種中是從一個(gè)以上的微生物復(fù)合體中鑒定出來的。

Fig.5 KO genes encoded in the subgingival microbiome with different prevalence among clinical states and between T2DM and ND subjects. A total of 373 KO genes with different
prevalence among the clinical states in T2DM and ND are shown. The bacterial species, which the KO genes belong to, are indicated by the color bars on the right according to
Socransky’s designation of the bacterial complexes. The KO genes labeled in brown are identified in the species from more than one microbial complex.

進(jìn)一步研究了某些微生物功能途徑是否與牙周炎和2型糖尿病相關(guān)，發(fā)現(xiàn)牙周臨床狀態(tài)不同患病率的KO基因在21條功能通路中顯著富集(超幾何分布檢驗(yàn))(圖6)。其中，確定了與牙周炎相關(guān)的微生物途徑，包括4條富含毒力因子的途徑，它們在T2DM和ND的牙周炎菌群中分布更為普遍。它們是與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(細(xì)菌運(yùn)動(dòng)、鞭毛組裝和細(xì)菌趨化)相關(guān)的通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)T2DM和ND之間微生物途徑的檢出率存在差異。脂肪代謝的兩條途徑(醚脂代謝和花生四烯酸代謝)和碳水化合物代謝的一條途徑(肌醇磷酸代謝)在牙周炎狀態(tài)僅在ND組出現(xiàn)，而在T2DM組未見。相反，T2DM牙周炎狀態(tài)和健康狀態(tài)下的碳水化合物代謝的3條途徑(丁酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、抗壞血酸和醛酸代謝)在牙周炎狀態(tài)和健康狀態(tài)下均明顯高于ND組。

圖6.與牙周炎和2型糖尿病相關(guān)的微生物途徑 在21條微生物途徑中，KO基因顯著富集，在T2DM和ND組不同牙周臨床狀態(tài)中，KO基因的患病率不同。熱圖左側(cè)顯示了在每個(gè)途徑中識別的已知毒力因子的比例。

Fig. 6 Microbial pathways associated with periodontitis and T2DM. Twenty-one microbial pathways were significantly enriched with KO genes that were different in prevalence
between clinical states in T2DM and ND. The proportion of known virulence factors identified in each pathway is shown to the left of the heatmap.

4 討論

糖尿病和牙周炎都是世界上成年人的普遍罹患的慢性病。這兩種疾病的發(fā)病機(jī)制相互關(guān)聯(lián)。糖尿病增加了牙周炎的患病風(fēng)險(xiǎn)，反過來牙周炎癥也對血糖控制產(chǎn)生不利影響。雖然高血糖與牙周炎的嚴(yán)重程度之間存在明顯的關(guān)系，而且全身炎癥狀態(tài)、免疫功能、中性粒細(xì)胞活性和細(xì)胞因子生物學(xué)都與發(fā)病機(jī)制有關(guān)，但這兩種疾病之間聯(lián)系的機(jī)制還不是很清楚。

本研究的目的是從微生物組的角度闡明T2DM和牙周炎之間的聯(lián)系。研究了T2DM患者和全身健康受試者在牙周健康、牙周炎和炎癥消退狀態(tài)的宏基因組水平上的齦下微生物群差異。發(fā)現(xiàn)兩組在牙周炎狀態(tài)下的齦下微生物群與健康狀態(tài)下不同。利用微生物組指數(shù)，發(fā)現(xiàn)與ND組相比，T2DM組的微生物組從健康狀態(tài)向牙周炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變的程度較小。即便牙周炎的臨床表現(xiàn)同樣明顯，T2DM患者的齦下菌群并沒有像ND那樣具有明顯的紊亂特征(圖2)。這表明T2DM患者對牙周致病菌的耐受性較差，牙周炎表現(xiàn)得更早，可能是由于宿主代謝失調(diào)和免疫反應(yīng)上調(diào)引起的。本研究結(jié)果支持，在T2DM患者中更頻繁地監(jiān)測齦下微生物群和/或強(qiáng)調(diào)更嚴(yán)格的生物膜控制是非常有必要的，因?yàn)槲⑸锶旱奈⑿∽兓赡軙谔悄虿』颊咧幸l(fā)牙周炎。

除了觀察到T2DM和ND受試者之間的總體微生物組差異外，本研究還分析了與牙周炎相關(guān)的單個(gè)微生物細(xì)菌的差異。眾所周知，細(xì)菌在牙齒表面的定植和生物膜的發(fā)育與牙周病密切相關(guān)。鏈球菌(黃色復(fù)合體)和放線菌是已知的早期定植物種，它們與牙齒表面膜中的唾液受體結(jié)合。具核梭桿菌(橙色復(fù)合體)是與包括致病性紅色復(fù)合體在內(nèi)的晚期定植菌相互作用的關(guān)鍵橋梁菌，它能夠促進(jìn)細(xì)菌定植和生物膜形成和演替，從而進(jìn)展為牙周炎。致病性的紅色復(fù)合體在牙周炎狀態(tài)中都存在并且相互之間高度相關(guān)(圖4)，這與致病菌在牙周炎中協(xié)同作用的特點(diǎn)一致。比較T2DM和ND患者，發(fā)現(xiàn)T2DM患者在健康狀態(tài)下齦下微生物菌群中橙色復(fù)合體和紅色復(fù)合體的相對豐度均高于ND組(圖7)。這表明T2DM患者更容易處于齦下菌群的致病狀態(tài)，患牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)更高，這與臨床觀察是一致的。另一方面，在牙周炎治療后，本研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者齦下微生物群落中橙色復(fù)合體和紅色復(fù)合體的相對豐度均低于ND組，提示T2DM患者對牙周致病菌的耐受性較差，致病菌水平需要更低才能有效控制牙周炎癥。

圖7.T2DM和ND患者與牙周炎相關(guān)的齦下菌群特點(diǎn)。示意圖定量地說明了T2DM和ND患者在健康狀態(tài)、牙周炎和炎癥消退狀態(tài)下齦下微生物群組成的動(dòng)態(tài)變化。與健康和疾病相關(guān)的細(xì)菌是根據(jù)Socransky等人提出的齦下復(fù)合體，以及文獻(xiàn)中關(guān)于細(xì)菌相互作用來確定的。細(xì)菌的比例是根據(jù)本研究中它們的相對豐度來確定的。

Fig.7 Dynamics of the subgingival microbiome associated with periodontitis in T2DM and ND subjects. A schematic quantitatively illustrates the dynamic changes in the subgingival microbiome composition among the healthy state, periodontitis state, and resolved state in T2DM and ND. The health- and disease-associated species are depicted according to the subgingival complexes designated by Socransky et al. and the knowledge of bacterial interactions from the literature. The proportions of the species are scaled based on their relative abundances in our data from this study.

接下來，本研究揭示了可能將齦下微生物群與這兩種疾病聯(lián)系起來的微生物功能。確定了在不同牙周狀態(tài)下顯著豐富的21條途徑(圖6)。它們包括四條富含毒力因子的途徑，它們在T2DM和ND的牙周炎狀態(tài)中存在更為普遍。這些都是與牙周炎相關(guān)的致病途徑。例如，三條已確定的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)通路參與趨化性的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)牙周病原體的生長，并促進(jìn)它們穿過上皮細(xì)胞層進(jìn)入深層組織的定植。本研究還發(fā)現(xiàn)在牙周炎狀態(tài)下存在一個(gè)雙組分系統(tǒng)，它通過調(diào)節(jié)IX型分泌系統(tǒng)成分的基因表達(dá)，促進(jìn)微生物適應(yīng)宿主環(huán)境的變化，并調(diào)控毒力因子的成熟和運(yùn)輸。毒性因子的一個(gè)典型例子是蛋白酶牙齦素，它在牙周組織中引起炎癥和組織破壞。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了三種致病途徑，它們在ND牙周炎狀態(tài)中更為常見，而在T2DM中則不常見。它們包括脂質(zhì)代謝和肌醇磷酸代謝的兩條途徑，這兩條途徑通過脂蛋白相關(guān)磷脂酶(一組與口腔感染相關(guān)的炎性酶)聯(lián)系在一起。與ND患者相比，T2DM患者在上述途徑致病因子不富集的情況下就可以誘發(fā)牙周炎。

本研究還發(fā)現(xiàn)了有三條功能通路在T2DM組的牙周炎狀態(tài)和健康狀態(tài)下都富集，而在ND組無富集。其中包括參與碳水化合物代謝的途徑-丁酸代謝，戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化，以及抗壞血酸和醛酸的代謝，它們通過脫氫酶聯(lián)系在一起。抗壞血酸和醛酸代謝途徑與炎癥疾病有關(guān)，包括牙周炎和T2DM。它的下游途徑——戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化，可能負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)局部環(huán)境中的抗壞血酸水平。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)丁酸代謝途徑在T2DM患者的牙周健康狀態(tài)中表達(dá)豐富，而在ND患者中沒有。微生物丁酸代謝已被認(rèn)為是牙周炎癥的代謝標(biāo)志，丁酸可以影響胰島素敏感性。這些結(jié)果與流行病學(xué)研究一致，牙周感染對血糖控制有不利影響。因此，這些途徑可能潛是牙周炎和2型糖尿病之間潛在的微生物功能關(guān)聯(lián)。

樣本量較小是本研究的主要局限性所在。雖然這項(xiàng)研究中的受試者和樣本的數(shù)量與其他已發(fā)表的有關(guān)齦下微生物群的研究樣本量相差不多，但未來的確還需要對更大規(guī)模的隊(duì)列研究。本研究的另一個(gè)不足是T2DM和ND牙周健康組之間存在年齡差異，牙周健康的T2DM患者的平均年齡比牙周健康的ND受試者的平均年齡大(表1)。盡管如此，兩組之間的微生物組成也無顯著差異(p=0.189)（圖2）。以往的研究未表明這個(gè)年齡范圍內(nèi)年齡是否影響齦下微生物群的組成。另外，雖然T2DM和ND牙周炎患者在年齡上沒有顯著差異(p=0.29)，但本研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)疾病組之間的微生物群存在顯著的差異。

5 結(jié)論

該研究首次對與牙周炎相關(guān)的高易感人群T2DM和健康受試者的齦下微生物群進(jìn)行了縱向宏基因組分析。揭示了T2DM和ND在不同牙周臨床狀態(tài)之間的菌群差異。本研究還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)種群的細(xì)菌間的相關(guān)性是不同的。這兩個(gè)結(jié)果都表明在進(jìn)展中的牙周炎中，T2DM患者更容易受到齦下微生物失調(diào)的影響。這項(xiàng)研究彌補(bǔ)了糖尿病人群中齦下微生物群的組成和治療后動(dòng)態(tài)變化的知識空缺，糖尿病人群患牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)更高。此外，本研究還鑒定了一組微生物基因，這些基因在與牙周炎相關(guān)的通路中富集，可能在T2DM與牙周炎之間相互關(guān)系中發(fā)揮作用。本研究從口腔微生物組的角度對T2DM和牙周炎的關(guān)系有了新的認(rèn)識，未來需要更大規(guī)模的隊(duì)列研究來證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

Baochen Shi, Renate Lux, Perry Klokkevold, Michaela Chang, Emma Barnard, Susan Haake, Huiying Li. “The Subgingival Microbiome Associated with Periodontitis in Type 2 Diabetes Mellitus.” The ISME Journal, vol. 14, no. 2, 2020, pp. 519–530. https:///10.1038/s41396-019-0544-3

責(zé)編：盧洪葉 北京大學(xué)

審核：劉永鑫 中科院