PCR 操作流程

X_DaDa 2020-09-23

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本文介紹了 PCR 的詳細操作流程，強調(diào)了實驗中的注意事項，列舉了常用緩沖液的配方。幫助我們在理解實驗的基礎(chǔ)上更順利的操作。

聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外合成雙鏈 DNA 的一種方法，其原理類似于天然 DNA的復制過程，其特異性主要依賴于與其目的片段兩端互補的特異引物和高特異性的酶（熱啟動酶）。典型的 PCR反應(yīng)有三個步驟：變性，退火，延伸，經(jīng)過多次循環(huán)反應(yīng)，獲得目的片段。

一．試劑準備

1.DNA 模板

2.特異性引物

3.dNTP Mix

4.PCR buffer

5.熱啟動酶

二．操作步驟

1.配置反應(yīng)體系

將各成分依次加入到 0.5ml 的離心管中

擴增使用熱啟動酶，可在常溫下操作，非熱啟動型的酶要在低溫配置反應(yīng)體系。

2.按照試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)時間和溫度，擴增結(jié)束后電泳鑒定

3.瓊脂糖核酸電泳

· 將電泳所用器具蒸餾水洗凈，架好梳子

· 根據(jù)要分離的 DNA 片段大小制備合適濃度的瓊脂糖凝膠，準確稱取一定的瓊脂糖加入到錐形瓶中，加入 30ml 左右的電泳緩沖液（TAE 或 TBE）

· 在微波爐中加熱融化后冷卻至 40℃左右，充分混勻后倒入電泳槽中

· 室溫下凝固 40 分鐘左右，小心拔出梳子，將凝膠放置電泳槽中準備點樣

· 在電泳槽中加入電泳緩沖液，漫過凝膠表面即可，點樣孔內(nèi)不要有氣泡

· 樣品點樣前準備好，（在八連管中）加入 5ul 樣品，1ul 的 6xLoding buffer 和 1ul 的染料混合，用搶將混合后的樣品緩緩注入到點樣孔中，注意不要串孔

· 按照正負極（紅正黑負），接通電源，電壓 40-60V，時間 30-40min，可根據(jù)溴酚藍的位置判斷是否終止電泳

· 電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，凝膠成像觀察，并對比 marker 確定片段大小

不同的瓊脂糖濃度分離不同大小的 DNA 片段：

三．注意事項

引物

引物是決定 PCR 反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，要保證擴增的準確、高效，引物的設(shè)計要遵循如下原則：

1. 引物的設(shè)計在 cDNA 的保守區(qū)域，在 NCBI 上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析的軟件，得到不同基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)

2. 引物的長度：15-28bp，長度大于 38bp，會使退火溫度升高，不利于普通 Taq 酶的擴增

3. 引物 GC 含量在 40%-60%，Tm 值最好接近 72℃

4. 因密碼子的簡并性，引物的 3’端最好避開密碼子的第三位（最好為 T）

5. 堿基分布錯落有致，3’端不超過 3 個連續(xù) G 或 C

6. 引物自身不要形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物設(shè)計完成，要 BLAST 驗證

模板

PCR 擴增對模板的要求不高，單鏈、雙鏈 DNA 均可作為擴增片段，雖然 PCR 能夠擴增微量的 DNA，為了保證擴增的特異性，對不同來源的模板，起始濃度有一定要求，如下：

模板可以是純化后的樣品也可以是粗制品，不同來源的模板采取不同的處理方法，實驗?zāi)０宓募兓胶唵卧胶?，但模板中如果含有任何?Taq 酶抑制劑、蛋白酶、核酸酶等，會干擾反應(yīng)。模板提取注意保存，不能放置太久，避免反復凍融并防止降解。多數(shù)人會忽略這一問題，當實驗結(jié)果沒有任何條帶時，可優(yōu)先考慮是否為模板降解的原因。

舉例：細菌 DNA 的提取方法

1. 取 1-2ml 的菌液，12000rpm 離心 10min，去除上清，得到沉淀

2. 根據(jù)得到沉淀量，加入 500ul 左右的 TE（配方如下）懸浮沉淀，并加入 20ul 的溶菌酶，37 度保溫 30min

3. 加入 30ul 10%的 SDS 和 1mg 蛋白酶 K，混勻后 37 度保溫 1h

4. 加入 120ul 5mol/l 氯化鈉，充分混勻，65 度放置 10min

5. 等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）充分混勻，12000rpm 離心 5min，得上清于干凈的 EP 管中

6. 等體積的氯仿：異戊醇（24:1）充分混勻，12000rpm 離心 5min，得到上清于趕緊 EP 管中

7. 加入等體積的異戊醇，充分混勻，-20℃放置 30min 后 10000rpm 離心 5min

8. 去除上清，得到 DNA 沉淀用 70%的乙醇漂洗（動作輕柔，不要講沉淀沖起），吸干，通?？色@得 3-5ug 的DNA

其他

1. Taq DNA 聚合酶：Taq 酶種類有很多，熱啟動酶，高保真酶，根據(jù)各自實驗的應(yīng)用選擇合適的酶擴增，一般的反應(yīng)，化學修飾的熱啟動酶即能很好的完成，化學修飾熱啟動酶能夠避免低溫下任何非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生。酶的濃度對擴增有一定影響，酶用量過多，會導致非特異性產(chǎn)物，操作按照說明書即可。

2. dNTP：四種 dNTP 的濃度要相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會引發(fā)堿基的錯誤滲入。此外，dNTP能夠和體系中鎂離子結(jié)合，從而影響體系中鎂離子的濃度。

3. 緩沖液：緩沖液一般隨酶提供，一般的 PCR 試劑盒包括 Taq 酶，緩沖液，dNTP，水。初次擴增，可以完全按照試劑盒的說明書操作，如果擴增結(jié)果有問題，可自己嘗試摸索實驗條件或重新設(shè)計引物提取模板擴增。

4. 因空氣中和手上有一定污染源，操作過程中要戴手套，在干凈的環(huán)境中配置反應(yīng)體系，防止空氣中的污染源。

5. PCR 擴增的水要經(jīng)過高壓滅菌或 0.2um 濾膜過濾。

6. 產(chǎn)物切膠回收二次擴增前，要先鑒定，二次擴增模板稀釋 1000 倍。