|
一、原理 電泳遷移率分析，也可稱作遷移電泳，凝膠電泳分析，凝膠遷移率分析，條帶移動(dòng)分析或者凝膠阻滯分析，這種方法常用來研究蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA的相互作用，對(duì)照泳道（不含蛋白質(zhì)的DNA/RNA探針）將出現(xiàn)單一的條帶。如果蛋白質(zhì)與片段結(jié)合，形成大的復(fù)合物，因此在凝膠上遷移的速度慢從來遷移率減低。 二、材料和試劑 1. DTT（Promega） 2. poly-dIdC（Sigma） 3. 32P-labeledprobe 4. BSA（Sigma） 5. 常用化學(xué)品試劑（Sigma） 6. 濾紙（GEHeathcare） 三、步驟 1. 制備聚丙烯酰胺凝膠 （1）裝配板，墊片，及夾具。用1%瓊脂糖封閉底部與側(cè)面，防止膠漏。 （2）5%聚丙烯酰胺凝膠的制備
（3）混勻，盡量減少泡沫的形成。加100 uL/50 uLTEMED。 2. 制備5×結(jié)合緩沖液。 3. 結(jié)合反應(yīng) 1 uL poly-dIdC（1ug/uLinTE） 2 uL 5x結(jié)合緩沖液 1 uL 標(biāo)記探針 如有必要加1uL未標(biāo)記的DNA探針片段（如競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)） 0.1 uL 100xBSA 若干體積（uL）的核提取物（5ug總蛋白） 加H2O到10 uL 總體積 室溫孵育30分鐘。如有必要可再加入蛋白抗體，使阻滯更加明顯，加抗體后再室溫孵育30分鐘。 4. 在結(jié)合反應(yīng)孵育的過程中，將膠裝在電泳槽，在0.5×TBE電泳緩沖液，150伏電壓下，預(yù)跑30分鐘，之后上樣，150 V 電泳2小時(shí)。 5. 制干膠（可選）：將膠轉(zhuǎn)移到濾紙上。膠上蓋濾紙，80℃真空干燥器中干燥1-2小時(shí)。 6. 壓片曝光在暗室中將膠放在暗盒中，放膠片。在-80℃條件下曝光。 |
|
|
