在過(guò)去的 25 年里，RNA 藥物逐步走向臨床。最初，RNA 并不是理想的藥物，因?yàn)?RNA 分子易降解，在體內(nèi)半衰期相對(duì)較短。然而，通過(guò)改善化學(xué)穩(wěn)定性使得 RNA 的半衰期得以延長(zhǎng)，發(fā)展成了藥物研發(fā)的新星。

事實(shí)上，RNA 分子擁有許多的屬性使得它可以作為治療藥物。它們能夠折疊形成復(fù)雜的構(gòu)象，以讓它們可以與蛋白質(zhì)、小分子或者其他核酸相互結(jié)合，有些甚至可以形成 RNA 的催化中心。編碼的 mRNA 是從 DNA 到核糖體的遺傳信息載體，許多類(lèi)型的非編碼 RNA 通過(guò)各種機(jī)制協(xié)同遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯，大量參與機(jī)制的發(fā)現(xiàn)大大拓寬了 RNA 的生物學(xué)應(yīng)用及延展。

目前有三類(lèi) RNA 療法受到廣泛關(guān)注：1）編碼治療性蛋白或疫苗抗原（mRNA）；2）抑制致病性 RNA 活性：小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）、微小 RNA(microRNA，miRNA)、反義 RNA(antisense RNA，ASO）；3)調(diào)控蛋白活性的 RNA 適配體（RNA aptamer）。

遞送系統(tǒng)是 mRNA 藥物的關(guān)鍵

1990 年，威斯康辛大學(xué)科學(xué)家首次證明，在動(dòng)物上直接注射體外轉(zhuǎn)錄的 mRNA 可以表達(dá)蛋白。1992 年，美國(guó) Scripps 研究所的一項(xiàng)工作展現(xiàn)了 mRNA 治療疾病的潛力，他們通過(guò)腦內(nèi)注射編碼加壓素（Vasopressin ）的mRNA，以增強(qiáng)加壓素的表達(dá)，成功緩解了大鼠的尿崩癥。

直接注射編碼原的 RNA 分子疫苗并被抗原遞呈細(xì)胞吸收后可誘發(fā)免疫應(yīng)答。通常情況下，mRNA 疫苗由酶工程生產(chǎn)，并能?chē)?yán)格控制免疫原性、藥物動(dòng)力學(xué)及劑量，且通過(guò)優(yōu)化 mRNA 的密碼子，可同時(shí)保持免疫原性及疫苗的穩(wěn)定性。

臨床試驗(yàn)表明，mRNA 的直接遞送（在脂質(zhì)體中）可產(chǎn)生明顯的保護(hù)性免疫反應(yīng)，mRNA 還可作為一種輔助劑來(lái)刺激先天性免疫反應(yīng)。RNA-Base 疫苗（RNA 為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的疫苗）可在幾周內(nèi)研發(fā)、制造和管理，也是解除未來(lái)流行病威脅的潛在武器。

根據(jù) Nature review drug discovery 上發(fā)布論文 RNA therapeutics on the rise 中的統(tǒng)計(jì)說(shuō)數(shù)據(jù)顯示，2015-2020 年，上市寡核苷酸公司市值增長(zhǎng) 94.2%，自 2015 年以來(lái)，三家具有代表性的 mRNA 治療公司（Moderna theraputics、BioNtech 和 CureVac）吸引了 28 億美元的私人投資。其中，Moderna 創(chuàng)下了生物科技 IPO 規(guī)模最大的紀(jì)錄，其價(jià)值在 2018 年約為 76 億美元，備受投資者青睞。

圖丨 RNA 療法領(lǐng)域的投資重點(diǎn)（來(lái)源：上述論文）

同時(shí)，RNA 技術(shù)在快速開(kāi)發(fā)疫苗發(fā)面的潛力在 COVID-19 流行期間展露無(wú)遺：第一批臨床 mRNA 疫苗 (mRNA - 1273， Moderna) 在新型冠狀病毒的基因序列發(fā)布后一個(gè)月內(nèi)就設(shè)計(jì)并合成出來(lái)，現(xiàn)在處于 Ⅰ 期臨床試驗(yàn)。另外還在其他的在研的 COVID-19 候選疫苗。

但 mRNA 技術(shù)的發(fā)展目前仍然處于早期。分子量大，以及蛋白翻譯機(jī)器對(duì)于去免疫原性和增加穩(wěn)定性所必須的化學(xué)修飾容忍度低等原因，讓 mRNA 藥物的發(fā)展滯后于小核酸藥物 ASO 和 siRNA。

首先，核酸藥物想要進(jìn)入體內(nèi)，主要有一下 3 個(gè)難關(guān)：1）核酸的分子量和負(fù)電荷使其不能自由通過(guò)生物膜；2）RNA 容易被血漿和組織中 RNase 酶降解，被肝臟和腎臟快速清除和被免疫系統(tǒng)識(shí)別；3）進(jìn)入細(xì)胞后 “卡” 在內(nèi)吞小體中無(wú)法發(fā)揮功能。

以上幾點(diǎn)讓 RNA 藥物發(fā)展面臨的技術(shù)障礙一直沒(méi)有變，那就是藥物遞送。目前，解決遞送問(wèn)題主要有兩個(gè)方法：一個(gè)是改造核酸分子，讓其穩(wěn)定并躲避免疫系統(tǒng)的識(shí)別；另外一個(gè)就是利用藥物傳輸系統(tǒng)，比如說(shuō)脂質(zhì)納米顆粒（LNP）和 GalNAc（N - 乙酰化的半乳糖胺）偶聯(lián)技術(shù)。

為了保證 mRNA 疫苗的代謝穩(wěn)定性和免疫活性，除了慎重評(píng)估給藥方式外，還需要對(duì) mRNA 疫苗的劑型進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)。mRNA 進(jìn)入體內(nèi)后，首先面臨周?chē)M中（如：血液）核酸酶的降解，另外還需要穿過(guò)具有磷脂雙分子層細(xì)胞膜。因此，mRNA 疫苗的制劑系統(tǒng)需要保護(hù) mRNA 不被核酸酶降解，而且還需要促進(jìn) mRNA 被細(xì)胞（APC、B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞）攝取。

已經(jīng)有大量的 mRNA 制劑系統(tǒng)見(jiàn)諸報(bào)道，其中的很多已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。這些制劑技術(shù)都是通過(guò)形成特殊的 mRNA 載體，來(lái)實(shí)現(xiàn) mRNA 疫苗的遞送，這些載體技術(shù)包括：魚(yú)精蛋白載體技術(shù)、納米顆粒脂質(zhì)體載體技術(shù)、多聚體載體技術(shù)等。

魚(yú)精蛋白是一種天然的陽(yáng)離子蛋白，可以把帶負(fù)電的 mRNA 分子絡(luò)合成納米級(jí)別的核酸顆粒，從而保護(hù) mRNA 不被血清中的 RNA 酶降解；但是由于魚(yú)精蛋白和 mRNA 的結(jié)合太緊密，因此采用這種制劑的 mRNA 疫苗的蛋白表達(dá)效率會(huì)受限，另外抗原的表達(dá)很大程度上也受到魚(yú)精蛋白和 mRNA 比例的影響。德國(guó) CureVac 公司開(kāi)發(fā)的 RNActive 平臺(tái)成功解決了這個(gè)問(wèn)題，通過(guò) RNActive 平臺(tái)得到的魚(yú)精蛋白 - mRNA 復(fù)合物其中，魚(yú)精蛋白作為 TLR7/8 拮抗劑可以誘發(fā) Th1 細(xì)胞反應(yīng)，mRNA 可以表達(dá)目的蛋白誘導(dǎo)特異的免疫反應(yīng)。

納米顆粒脂質(zhì)體（Lipid nanoparticles，LNPs）載體遞送 RNA 的原理目前還不完全清楚，但是通常認(rèn)為，LNP 通過(guò)非共價(jià)親和力和細(xì)胞膜結(jié)合并通過(guò)內(nèi)吞作用被攝取，進(jìn)入細(xì)胞后 mRNA 逃離內(nèi)吞小泡，被釋放到細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)靶蛋白。LNP 還可以通過(guò)相反的胞吐作用被排出細(xì)胞外，這也是通過(guò) LNP 進(jìn)行 mRNA 給藥需要注意的點(diǎn)。

多聚體載體技術(shù)在臨床上的應(yīng)用并沒(méi)有脂質(zhì)體類(lèi)載體廣泛，但是作為核酸藥物的載體也表現(xiàn)了優(yōu)異特性。在進(jìn)行多聚體載體設(shè)計(jì)的時(shí)候需要額外考慮多聚體載體的分子量以及帶電荷量，過(guò)大的載體分子和過(guò)多的載電量通常導(dǎo)致載體和 mRNA 分子結(jié)合太過(guò)穩(wěn)定，而導(dǎo)致 mRNA 的表達(dá)效率過(guò)低。

可見(jiàn)，遞送技術(shù)平臺(tái)是 mRNA 藥物的關(guān)鍵之一。目前 mRNA 還是需要依靠納米制劑遞送，所以肝臟、脾臟以外的組織還是難以靶向，同時(shí)，mRNA 藥物過(guò)膜性低也導(dǎo)致出現(xiàn)懸殊的個(gè)體差異，如果藥物過(guò)膜性是 1%，那么 1% 的個(gè)體差異會(huì)導(dǎo)致兩倍有效藥物濃度差異，但如果過(guò)膜性是 50%，那么 1% 的個(gè)體差異則無(wú)關(guān)緊要?，F(xiàn)在業(yè)界的策略是首先選擇疫苗這樣安全窗口較大的項(xiàng)目，但如果擴(kuò)大到更復(fù)雜靶點(diǎn)，業(yè)界需要找到可監(jiān)測(cè)藥物應(yīng)答的生物標(biāo)記。

小核酸藥物日漸成熟，遞送仍是瓶頸

目前狹義的小核酸是指介導(dǎo) RNAi 的短雙鏈 RNA 片段（siRNA），主要涵蓋了 siRNA、miRNA 和反義核酸等。由于 siRNA 藥物療效較好且技術(shù)取得突破，現(xiàn)已成為最受關(guān)注的一類(lèi)技術(shù)。

其中，反義核酸發(fā)現(xiàn)最早，獲批的藥物最多，發(fā)展較成熟，但反義核酸藥物不及 siRNA 藥物高效，siRNA 藥物在組織細(xì)胞遞送上尚有一定的瓶頸，2018 年上市的首個(gè) siRNA 藥物已經(jīng)可以有效遞送到器官和組織，隨著藥物遞送系統(tǒng)的進(jìn)一步突破，siRNA 藥物將逐漸替代反義核酸藥物，成為主流 RNAi 藥物。

而 miRNA 與 siRNA 通過(guò) 21 個(gè)核苷酸完全配對(duì)的作用機(jī)理不同，只需要 2-8 位核苷酸的配對(duì)就能起作用。因此 miRNA 通常是作用于一個(gè)面，而非一個(gè)點(diǎn)，作用于一個(gè)協(xié)同的網(wǎng)絡(luò)而非單條通路，相關(guān)技術(shù)還待進(jìn)一步突破。

2005 年至 2009 年，RNAi 領(lǐng)域吸引了數(shù)十億美元的資金投入，催生了眾多小型生物技術(shù)

公司，但行業(yè)發(fā)展遭遇瓶頸。2006 年默沙東以 11 億美金收購(gòu)專(zhuān)門(mén)開(kāi)發(fā) RNAi 藥物的 Sirna 公司；2007 年，羅氏與 Alnylam 制藥公司簽訂了一項(xiàng)價(jià)值高達(dá) 10 億美元的協(xié)議，獲得該公司 RNAi 技術(shù)。但 RNAi 藥物治療的效果遠(yuǎn)不及預(yù)期，系統(tǒng)給藥效果差和脫靶造成的嚴(yán)重副作用成為最大障礙，藥物嚴(yán)重的副反應(yīng)始終無(wú)法克服，研發(fā)陷入了困境。第一輪資本的進(jìn)入雖然沒(méi)有取得預(yù)期的回報(bào)，但卻在一定程度上推動(dòng)了行業(yè)的發(fā)展，使得 Alnylam、Quark 和 Arrowhead 等公司成長(zhǎng)起來(lái)。

小核酸藥物領(lǐng)域的研發(fā)有以下方向，一方面，基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序成本降低，為小核酸藥物產(chǎn)業(yè)化提供了可能；另一方面，RNA 修飾技術(shù)使得 RNA 在血液中的穩(wěn)定性增加，給藥系統(tǒng)突破使得藥物更高效安全。

2013 年—2016 年，陸續(xù)有反義核酸藥物獲批上市。2014 年賽諾菲（Sanofi）以 7 億美元收購(gòu)了 Alnylam12% 的股份，但研發(fā)也是困難重重；Arrowhead 公司功能性治愈乙肝的 RNAi 藥物 ARC-520 因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)生動(dòng)物死亡而停止 II 期研發(fā)；2016 年，Alnylam 的 RNAi 藥物 Revusiran 在三期臨床階段失敗，造成 18 名患者死亡，使得其當(dāng)時(shí)股價(jià)被腰斬，遭受重挫。

直到 2016 年底，技術(shù)的突破、新產(chǎn)品的獲批掀起了新一輪的投資合作熱潮。百健 / Ionis 治療脊髓性肌萎縮癥（SMA）的反義寡核苷酸 Nusinersen 被 FDA 批準(zhǔn)上市，2017 年即取得 8.82 億美元銷(xiāo)售，業(yè)內(nèi)普遍給出銷(xiāo)售峰值達(dá) 20 億美元的預(yù)估。2017 年，Patisiran 臨床三期結(jié)果超出預(yù)期，標(biāo)志核酸干擾藥物的重大突破，行業(yè)重拾信心。2018 年，Ionis 和 Alnylam 的治療由 hATTR 引起的多發(fā)性神經(jīng)病的兩款孤兒藥陸續(xù)獲批，其中 Patisiran 成為全球第一個(gè)獲批的 siRNA 類(lèi)的小核酸藥物，對(duì)整個(gè)領(lǐng)域有巨大的振奮作用。與此同時(shí)，資本紛紛回歸 RNAi 領(lǐng)域，掀起了第二次的投資熱潮。

小核酸藥物的適應(yīng)癥涵蓋范圍廣，包括腫瘤、罕見(jiàn)?。∥s性脊髓側(cè)索硬化、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮）、病毒性疾病、腎臟疾病、心血管疾病（凝血功能不足、血脂異常等）、炎癥類(lèi)疾病（哮喘、關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎）、代謝類(lèi)疾?。ㄌ悄虿　⒎蔷凭灾拘愿窝祝┑?，其潛在市場(chǎng)規(guī)模十分廣闊。

其中，罕見(jiàn)病和腫瘤是小核酸藥物應(yīng)用最廣的領(lǐng)域。截至目前，已經(jīng)有 9 款小核酸藥物獲批上市，其中有 5 個(gè)藥物為孤兒藥，同時(shí)也是該疾病領(lǐng)域的首個(gè)藥物，一定程度上滿(mǎn)足了此前尚無(wú)治療手段的罕見(jiàn)病人的需求。

生命科學(xué)商業(yè)資訊機(jī)構(gòu) EvaluatePharma（EP）在世界罕見(jiàn)病日發(fā)布的一份報(bào)告（EvaluatePharma Orphan Drug 2017 Report）表明：2016 年罕見(jiàn)病藥的總銷(xiāo)售額為 1140 億美元，占全球非仿制藥市場(chǎng)的 16.4％。至 2022 年，這一數(shù)字將上升為 2090 億美元，罕見(jiàn)病藥銷(xiāo)售將占整個(gè)市場(chǎng)的 21.4％。RNAi 技術(shù)能夠針對(duì)已知的罕見(jiàn)病基因發(fā)揮作用，克服了某些靶點(diǎn)蛋白難以成藥的缺點(diǎn)，能較快取得突破。報(bào)告預(yù)計(jì) 2025 年，小核酸藥物市場(chǎng)規(guī)模將遠(yuǎn)超 100 億美元。

圖丨已經(jīng)上市和正在申請(qǐng)上市的 RNA 療法（來(lái)源：上述論文）

而發(fā)展火熱的小核算藥物并非沒(méi)有缺點(diǎn)，例如，2009 年，首個(gè)開(kāi)展 siRNA 臨床試驗(yàn)的藥物 Bevasiranib，因?yàn)樾Ч芳讯?III 期臨床試驗(yàn)終止測(cè)試。靶向性差，脫靶效應(yīng)及穩(wěn)定性問(wèn)題是影響 siRNA 藥物療效的最主要因素。1）靶向性差：siRNA 是帶負(fù)電荷的生物活性大分子，不具備對(duì)組織或細(xì)胞的靶向能力，穿透細(xì)胞膜的能力極差。2）脫靶效應(yīng)嚴(yán)重：除了 siRNA 分子的反義鏈能夠介導(dǎo)同源基因的表達(dá)沉默外，反義鏈能通過(guò) miRNA 通路引起一些非同源基因的抑制，正義鏈介導(dǎo)其同源基因的表達(dá)沉默，引起由正義鏈介導(dǎo)的脫靶效應(yīng)；同時(shí)未修飾的雙鏈 RNA 也會(huì)引起一些先天免疫機(jī)制的激活。而在小核酸制藥中，這些都會(huì)產(chǎn)生藥物的毒副作用，嚴(yán)重地影響了 RNAi 技術(shù)的應(yīng)用。3）穩(wěn)定性差：RNA 在人體循環(huán)系統(tǒng)中容易被血液核酸酶降解，穩(wěn)定性較差。

因此，與 mRNA 類(lèi)似，遞送平臺(tái)開(kāi)發(fā)是整個(gè)鏈條的重點(diǎn)，目前，為了解決這一問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外藥物遞送系統(tǒng)技術(shù)的研發(fā)如火如荼，重點(diǎn)聚焦在脂質(zhì)納米顆粒（LNP）和 GalNAc（N - 乙?；陌肴樘前罚┡悸?lián)技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用上。

RNA 適配體暫居產(chǎn)業(yè)邊緣

1990 年 8 月份，美國(guó) Colorado 大學(xué)和麻省總醫(yī)院的科學(xué)家（L. Gold 和 J. Szostak）分別在 Science 和 Nature 發(fā)表文章，顯示通過(guò)體外進(jìn)化和篩選，可以得到與目標(biāo)分子緊密結(jié)合的 RNA 分子，親合力和特異性與單抗相當(dāng)。他們把這個(gè)篩選過(guò)程叫做”Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment（SELEX）”。而 Aptamer 這個(gè)名字則是來(lái)自拉丁文字“aptus”，意思是“to fix”，中文翻譯為“適配體”。

Gold 和 Szostak 的這一突破性研究證實(shí)核酸分子能夠借助氫鍵、范德華力、疏水作用等分子間作用力形成與分子靶標(biāo)相作用的結(jié)合口袋和裂隙(binding pockets and clefts)，借助這些特殊的三維立體結(jié)構(gòu)，高親和力和特異性的識(shí)別并結(jié)合靶分子。

SELEX 符合適者生存的進(jìn)化原理，RNA 文庫(kù)與靶標(biāo)孵育一定時(shí)間后，未結(jié)合的分子被移除，而結(jié)合的分子洗脫后經(jīng) RT-PCR 擴(kuò)增形成新的化合物庫(kù)，重復(fù)上述過(guò)程，經(jīng)過(guò) 8-20 輪篩選，一般能得到高特異性和高親和力的適配體，目前學(xué)術(shù)報(bào)道的用于治療和診斷的適配體超過(guò) 1000 個(gè)。 

業(yè)內(nèi)常將核酸適配體和抗體進(jìn)行比較，是因?yàn)閮烧呔哂泻芏嘞嗨浦?。兩者都具有親和性和特異性，都可與靶向目標(biāo)特異性結(jié)合，并因此特性應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。但隨著篩選技術(shù)研究的發(fā)展，越來(lái)越多的靶分子獲得高親和力的、高特異性的適配體，具有廣泛的應(yīng)用前景，特別是分子識(shí)別檢查的領(lǐng)域。但與成熟的抗體實(shí)驗(yàn)相比，目前適配體可以補(bǔ)充抗體性能的不足，但是不能完全取代抗體。

雖然核酸適配體發(fā)展將近 30 年的時(shí)間，但仍有很多問(wèn)題阻礙了其實(shí)際應(yīng)用的腳步。例如體內(nèi)表現(xiàn)很差，在血液中易被降解；核酸分子結(jié)構(gòu)太小，腎清除速度快，作為藥物時(shí)藥物動(dòng)力學(xué)性能差；核酸適配體作為核酸分子探針，化學(xué)作用力非常有限，增加了不易被結(jié)合的靶標(biāo)分子的時(shí)候篩選難度，且靈敏度不夠高；利用適配體發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)時(shí)，缺乏高通量篩選及鑒定的方法；作免疫組化應(yīng)用時(shí)，可用的特異性適配體還較少，臨床應(yīng)用不受認(rèn)可，亟待推廣等等問(wèn)題，讓適配體應(yīng)為范圍較小，處在產(chǎn)業(yè)邊緣。

結(jié)語(yǔ)

RNA 世界隱藏著眾多具有治療潛能的分子。然而，除 RNA 藥物設(shè)計(jì)階段的障礙，如免疫原性外，最核心的難題，如遞送、脫靶副作用、一般毒性等問(wèn)題，在之后的臨床試驗(yàn)中難以避免。目前，雖然以納米級(jí)非病毒顆粒為代表的遞送系統(tǒng)不斷發(fā)展，但效率低、缺乏靶向性機(jī)制等問(wèn)題仍沒(méi)有取得突破性進(jìn)展。

生輝認(rèn)為，RNA 藥物的研發(fā)誰(shuí)執(zhí)牛耳，其核心仍在于技術(shù)，能在關(guān)鍵技術(shù)上有所突破者才能成為真正的冠軍公司。

參考：

https://www.ncbi.nlm./pubmed/25196947

https://www./publication/21464693_Direct_gene_transfer_into_mouse_muscle_in_vivo

https://www.ncbi.nlm./pubmed/1546298

https://www.ingentaconnect.com/content/ben/cmc/2005/00000012/00000015/art00005

https://www.ncbi.nlm./pubmed/2200121

https://www.ncbi.nlm./pubmed/1697402

https://www./articles/d41573-020-00078-0

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