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T細胞特異性殺傷腫瘤的特性為將來的腫瘤治療帶來無限可能，現(xiàn)今CAR-T細胞免疫療法正處在快速發(fā)展階段，不管是在臨床前試驗還是最近獲批用于白血病和淋巴瘤的生物藥品，CAR-T細胞療法都是很有前景的腫瘤免疫治療技術。近日，最新一期《Science》刊登了CAR-T細胞治療領域的大咖Carl June的一篇綜述，全面講述了CAR-T細胞療法的研究歷程及未來面臨的機遇和挑戰(zhàn)，快來跟小編一起飽嘗這頓CAR-T細胞領域的大餐吧。 臨床上第一個TCR-T細胞免疫療法應用在了轉移性黑色素瘤患者中，這項試驗中應用的TCR是將HLA-A2限制性多肽與黑色素細胞分化抗原MART-1相結合。后為了提高對MART-1低表達惡性細胞的識別，在此基礎上又研制出了一種對MART-1抗原具有高親和力的TCR。雖然有效率得到提高，但脫靶效應也相繼而來：這種具有高親和力的TCR靶向了皮膚、眼睛和耳蝸中正常的黑色素細胞。試驗當中過半數(shù)的患者都出現(xiàn)了這種脫靶毒性，這也帶來一個新啟示：當針對腫瘤相關性抗原時，其有效率跟毒性之間真的是分不開的。 TCR療法在開發(fā)過程中也遭受了重創(chuàng)。2011年，在NCI進行的靶向癌睪丸抗原MAGE-A3的TCRs治療實體瘤的臨床試驗中，開始接受治療的9例患者中有3例患者在接受治療后立即出現(xiàn)嚴重的精神癥狀，其中的兩例迅速陷入昏迷，并不幸去世。后續(xù)的研究表明這種MAGE-A3 TCR意外地能夠與在大腦中的相關多肽MAGE-A12相結合。 直接靶向MAGE-A3 的這兩種TCR療法中出現(xiàn)的嚴重神經(jīng)和心臟毒性無疑是加重了TCR免疫療法的挑戰(zhàn)。然而,轉機來了，研究顯示與HLA-A2限制性多肽親和力更強的靶向癌睪丸抗原NY-ESO-1 TCR-T細胞顯示出臨床療效，重要的是并沒有出現(xiàn)明顯的毒性。這些試驗結果重新燃起了研究者的希望。目前NYESO-1 TCR-T細胞正在進行后期的臨床試驗評估。 TCR-T療法和CAR-T療法的制備工藝都是對患者自身的T淋巴細胞進行體外改造，然后再輸注回患者體內(nèi)殺傷腫瘤，但是這兩種療法識別抗原的機制卻截然不同。TCR是利用α和β肽鏈構成的異二聚體來識別由MHC呈現(xiàn)在細胞表面的多肽片段。而CAR則是利用能夠與特定抗原結合的抗體片段來識別腫瘤細胞表面的抗原。 從細胞表面蛋白和細胞內(nèi)蛋白中獲得的肽鏈MHC分子都可以呈遞，因此TCR可以靶向更多種類的抗原，而CAR-T細胞只能靶向腫瘤細胞表面抗原。但CAR也突破了TCR-T細胞療法上的一些限制，比如TCR-T需要MHC表達，MHC一致性和協(xié)同共刺激信號。腫瘤免疫耐受的一種重要機制就是腫瘤細胞上MHC相關的抗原呈遞因子表達缺失，因此CAR-T細胞也就明顯具有了重要的抗腫瘤優(yōu)勢。 
圖1 CAR與TCR結構設計 第一代CAR-T研發(fā)出來以后很快就被投入臨床，雖能看到一些特異性的細胞毒性，但在2006年進行臨床試驗總結時卻發(fā)現(xiàn)療效差強人意。究其原因，第一代CAR-T細胞在病人體內(nèi)很快就會耗竭，持久性很差，以至于CAR-T細胞還沒有來得及接觸到大量的腫瘤細胞時就已經(jīng)凋亡。 在2011年，靶向CD19和編碼共刺激區(qū)域的第二代CAR-T技術成為T細胞治療的主流。CD19是正常和惡性B淋巴細胞特異性表達的表面蛋白，在B細胞發(fā)育、增殖和分化以及惡性轉化中發(fā)揮重要作用。CD19在B淋巴細胞表達的特異性和在惡性腫瘤表達的廣泛性，使其在治療B淋巴細胞惡性腫瘤時頗具潛力。大部分的復發(fā)性白血病患者在接受了CD19 CAR-T治療后達到完全緩解。但免疫耐受也同樣出現(xiàn)了，在急性白血病患者中， CD19抗原表位缺失似乎是腫瘤免疫耐受的主要機制。這跟在TCR-T療法中觀察到的獲得性抗原呈遞缺陷或抗原缺失導致的抗原逃逸機制很像。成人和兒童急性白血病患者的國際性試驗數(shù)據(jù)顯示，CD19陰性缺失所導致的復發(fā)概率竟達到28%。目前還沒有報道說CD19缺失是慢性淋巴細胞白血病耐受的原因；推測慢性淋巴細胞白血病出現(xiàn)耐受可能是因為CAR-T細胞輸注后在體內(nèi)的擴增受限。 CAR-T技術目前得到廣泛應用。除了CD19，靶向BCMA和CD22的CAR-T細胞治療也相繼被投入臨床。早期臨床試驗結果顯示，靶向后兩種靶點在多發(fā)性骨髓瘤和急性淋巴細胞白血病中也出現(xiàn)了與CD19相似的抗瘤活性，跟CD19一樣，這兩種抗原同樣在B細胞譜系中具有高度特異性。 從CAR-T細胞療法評估其他靶點的早期臨床試驗結果來看，CD19的脫靶交叉反應雖并非個例，但在其他靶點中更常見。靶向BCMA或CD269的晚期骨髓瘤臨床試驗結果顯示，除了惡性骨髓瘤細胞，表達BCMA的非惡性漿細胞也被清除了，而靶向哪種正常的組織或細胞決定了對這種脫靶毒性的耐受性。 ERBB2/HER2蛋白是一種酪氨酸受體激酶，在腫瘤細胞中廣泛過表達，是抗體或抗體結合劑的有效靶點。但靶向ERBB2/HER2的CAR-T療法在第一例患者中就出現(xiàn)了致命的毒性。后來的第三代CAR技術的應用研究顯示，這種毒性是由于低表達ERBB2的肺上皮細胞被錯誤識別并殺傷，導致了肺損傷和大量細胞因子釋放。 而靶向CAIX的第一代CAR-T細胞在腎細胞癌的I期臨床試驗中也遭遇了意外的肝臟毒性，這種肝毒性是由于CAIX抗原在正常膽管上皮細胞中低表達，而這種毒性在臨床前試驗階段并未被發(fā)現(xiàn)。 靶向CEACAM5的CAR-T細胞治療所帶來的延遲呼吸毒性與T細胞擴增也表明了靶向這種抗原或許可以帶來抗瘤療效和脫靶毒性。 靶向其他腫瘤相關性抗原的CARs臨床試驗，包括間皮素、癌胚抗原、GD2神經(jīng)節(jié)苷脂，并沒有顯示出明顯的毒性，但抗瘤活性也很小。在臨床前階段GD2 CAR-T細胞抗瘤活性增強，但也引起了非常嚴重的神經(jīng)毒性，這加劇了接下來的挑戰(zhàn)。 而在多形性膠質細胞瘤中局部注射靶向IL13Rα2的CAR-T細胞證實其具有抗瘤活性，而且沒有發(fā)現(xiàn)明顯的毒性。這提示直接靶向抗原進行瘤內(nèi)注射或可增加治療指數(shù)。 靶向EGFRvIII的CAR-T細胞療法相對安全，但一些患者也出現(xiàn)了瘤內(nèi)EGFRvIII抗原缺失，這也進一步說明靶向多種抗原有利于防止抗原逃逸。 腫瘤微環(huán)境也是過繼性細胞免疫治療成功應用要面臨的另一道很高的門檻，尤其在實體瘤中。目前研究比較清楚的抑制T細胞免疫活性的因子包括免疫檢查點、腫瘤代謝微環(huán)境的改變、調(diào)節(jié)T細胞和MSC細胞。過繼細胞輸注后瘤內(nèi)這些免疫和代謝抑制因子的上調(diào)，意味著即將出現(xiàn)獲得性耐受。CD19 CAR-T細胞聯(lián)合PD-1/PD-L1抑制劑的臨床試驗目前正在進行中。此外，聯(lián)合其他免疫檢查點抑制劑的臨床試驗也在開展中。 2.2 CAR-T細胞治療的毒性反應及機制 CAR-T細胞治療的常見毒性為嚴重的細胞因子釋放綜合征。這種綜合征甚至比TIL和TCR-T細胞治療中常見的流感樣綜合征更厲害。研究顯示，CRS的嚴重分級與腫瘤負荷相關。最嚴重的CRS會出現(xiàn)包括嗜血細胞性淋巴細胞病和巨噬細胞激活綜合征等。 除了CRS，CD19和BCMA CAR-T細胞的臨床試驗中還報道了不同程度的神經(jīng)并發(fā)癥。CD19 CAR-T細胞引起的神經(jīng)毒性大部分是可逆的。但腦水腫是CRS的一種極端形式還是另有機制還不清楚。有證據(jù)表明內(nèi)皮損傷可能與導致神經(jīng)毒性的炎癥細胞因子有關，這大大支持了另有機制這一說法。 
圖2 CAR-T細胞治療的毒性反應 受體和配體的親和力是影響大多數(shù)受體通路的重要生化因素。親和力的工程化或許可以應用于CAR的設計來增加CAR-T細胞的抗瘤活性，調(diào)節(jié)靶向療效和脫靶毒性。ERBB2/HER2編碼的細胞表面受體與很多上皮細胞惡性腫瘤的病理相關。CAR與ERBB2/HER2親和力的多樣性增加了對抗原表達的辨別，就是說可以提高對正常上皮細胞上發(fā)現(xiàn)的低表達抗原和腫瘤細胞上高表達抗原的辨別能力。但顯然，最佳親和力的辨別并非那么簡單，就像GD2 CAR臨床前試驗結果:腫瘤活性的提高也伴隨嚴重神經(jīng)毒性。除了親和力，目前研究大力投入的還有CAR的胞外結構及跨膜結構和信號。遺憾的是，幾乎沒有明確的評價標準，而且CAR設計也存在很強的經(jīng)驗主義。此外，臨床前試驗結果不清晰也增加了CAR設計的復雜度。 基于MHC的限制，傳統(tǒng)的CAR-T療法中T細胞主要來源于患者自身。如果MHC的阻礙可以被克服，那么，相比患者自身的T細胞，異體供體或通用型T細胞治療就具有了長足的優(yōu)勢。而且來自健康人的通用型CAR-T還有可能克服很多癌癥治療相關的免疫缺陷。再者通用型CAR-T療法可以以工業(yè)級的標準進行提前制備，并且不受患者自身T細胞質量的影響。 Torikai教授的工作組是第一個采用基因編輯技術制備通用型CAR-T細胞的，這種通用CAR-T細胞中不含功能性內(nèi)源TCR。基于TALEN基因編輯技術制備的通用型CAR-T，應用到兩例患者的試驗證實了通用型CD19 CAR-T療法的可行性。但是，在這項試驗中，通用型CAR-T細胞在體內(nèi)擴增受限，因此這兩例患者并未取得療效。重要的是，在MHC I類等位基因錯配的一位患者中出現(xiàn)了移植物抗宿主病，這可能與未被編輯的受污染的T細胞仍然存在內(nèi)源性TCR有關，這也提示我們，通用型CAR-T療法要想獲得成功需要更完善的基因編輯技術。盡管阿倫單抗（免疫調(diào)節(jié)藥物）可以調(diào)節(jié)免疫抑制，但NK細胞對MHC I類分子缺失細胞的識別仍然帶來一定的局限性。抑制NK細胞對通用型CAR-T細胞溶解的方式是插入HLA-E，敲除HLA-A，-B和-C，來阻止自身T細胞攻擊通用CAR-T細胞。鑒于該領域的快速發(fā)展，通用CAR-T細胞很可能會被廣泛使用。關鍵的問題就在于通用型CAR-T細胞能不能像干細胞移植或自體CAR-T細胞治療那樣作為單一療法或輔助療法進行應用。 目前有很多技術可以實現(xiàn)在DNA中引入靶向雙鏈斷裂的有效插入或刪除，從而使靶基因失活。同源性修復可以用于在靶點插入感興趣的基因。目前有很多基因編輯工具，而且這些技術也已經(jīng)成功應用于工程T細胞。這個領域主要的難題在于細菌衍生的Cas9能否產(chǎn)生有效的免疫原性來干擾CRISPR-Cas9編輯的T細胞的傳遞。基因編輯技術帶來了一種新的機遇，敲除CTLA-4或PD-1免疫抑制信號，可以增強T細胞功能，甚至可能都沒有免疫檢查點抑制劑的毒性?；蚓庉嫾夹g還可用于敲除T細胞中CAR靶向的基因，這種基因雖可使CAR-T細胞靶向腫瘤相關抗原，但卻使T細胞免疫療法失效。最近，Eyquem教授研究組將CAR引入TCR中，這樣受體表達可以被內(nèi)源性TCR啟動子所控制，從而顯著提高CAR-T細胞的功能。 單一抗原區(qū)別腫瘤細胞和正常組織的能力有限，應用也受到限制。為了提高靶向腫瘤的特異性，聯(lián)合傳感方式可靶向兩個或更多抗原。研究顯示，合成的Notch信號通路可以通過轉錄方式結合雙重抗原（《Science》長文：治療實體瘤更有效的CAR-T療法 | 白澤專欄）。結合抗原傳感系統(tǒng)來理解CAR表達的動力學特征很重要，因為生理參數(shù)的轉變可發(fā)生在CAR-T細胞輸注后的幾個小時內(nèi)，當細胞內(nèi)仍保持CAR表達，可能仍然可以調(diào)節(jié)毒性。 為了減輕細胞回輸帶來的自身免疫反應風險， 研發(fā)了“自殺開關“，它可以誘導工程T細胞自發(fā)走向死亡。比如，引入FKBP2雙聚小分子（iCasp9的雙聚體分子），T細胞就會快速走向凋亡。在造血干細胞移植后同種異體淋巴細胞輸注中，iCasp9方法已經(jīng)得到了評估，并證明了可有效清除T細胞，可減輕自身免疫疾病。 目前全球正在進行的CAR-T臨床試驗超過了250項。這些臨床試驗的數(shù)量存在地區(qū)差異，中國和美國CAR-T臨床試驗最多，成為轉化研究的熱門地區(qū)，而歐洲、日本和南半球相對來說要少很多。當然，出現(xiàn)這種地區(qū)差異的原因很復雜，包括對這種新療法的接受和投資力度，衛(wèi)生部門的監(jiān)管政策以及社會文化的差異等。 圖4 CAR-T細胞療法開展臨床試驗的地區(qū)差異 血液瘤患者所接受的有效但非治愈性療法帶來的經(jīng)濟負擔也是很大的挑戰(zhàn)，特別是對CLL和多發(fā)性骨髓瘤患者。作為美國最常見的白血病形式，2000年約有100000名CLL患者，治療只能改善生存狀況，并不能達到治愈，因此給患者和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。據(jù)估計，每例患者終生的治療費用為604000美元，而到2025年，僅美國的CLL疾病管理總費用估計每年就要超過50億美元。 跟傳統(tǒng)療法相比，CAR-T細胞治療可能更具成本效益。但高度個性化的細胞免疫治療，制備工藝也需要個性化，這大大增加了成本。相信隨著制備工藝越來越成熟，CAR-T細胞治療的成本肯定能降低到普通百姓能用得起的價格。 總的來說， CAR-T細胞療法對于血液瘤絕對是一個突破。更重要的是，CAR-T是FDA批準的第一種轉基因療法。目前，細胞免疫治療面臨的最大挑戰(zhàn)是缺乏臨床前模型來評估藥物的安全性和有效性。另外就是，在實體瘤方面的療效還需要更大的突破。 但值得期待的是，隨著工程T細胞、基因編輯和細胞制備工藝的發(fā)展，T細胞治療很可能可以擴展到其他類型的細胞，比如多功能干細胞、造血干細胞和NK細胞，而且適用的疾病也不再單單是腫瘤，還可能是傳染病、器官移植或自身免疫性疾病。 1. Carl H. June, et al. Science 359, 1361–1365 (2018) 2. Fesnak AD, et al. Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81.
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